生物显微技术 第一章 显微镜课件.pptVIP

生物显微技术 主讲教师：倪华 课程基础 细胞生物学 分子生物学 免疫学 第一章 显微镜 显微镜发展简史 1590年前后，荷兰人Hans父子发明了放大10倍的原始显微镜。 十七世纪英国物理学家虎克和意大利解剖学家马尔皮基设计了性能较好的显微镜用于植物学和医学研究。 40年代制造出来相差显微镜。 1932年德国人发明电子显微镜。 1960-1962制成超高压电镜。 80年代，研制成功扫描隧道显微镜。 第一节 光学显微镜 一、光学显微镜的原理与构造 成像原理 光射到物体上，再从物体射入物镜、目镜，最后射入观察者的眼睛，在此过程中成像并放大。 性能 分辨率： 放大率： 镜口率： 焦点深度： 镜像亮度： 视野亮度： 分辨率 分辨率是指能区分两个物点间最小距离的能力。两物点间的最小距离称为分辨距离。分辨距离越小，分辨率越高，也就是分辨细微结构的能力越大。 普通光学显微镜分辨率的极限是0.2μm。可把物体放大1500倍 。 放大率 最终成像的大小与原物体大小的比值称为放大率。 总放大率=物镜放大率×目镜放大率 显微镜的构造 光学系统 机械系统 光学系统 物镜 目镜 照明装置 滤光装置 物镜 分类 干燥系物镜 消色差物镜 油浸系物镜 复消色差物镜 水浸系物镜 平场物镜 功能：a 产生物体的第一次倒立实像。 b 放大作用 目镜 分类 惠更斯目镜 补偿目镜 平场目镜 广角目镜 功能：a 将物镜形成的倒立实像变成正立的虚像。 b 将像再放大4-16倍。 二、常用光学显微镜 普通显微镜 相差显微镜 暗视野显微镜 荧光显微镜 实体显微镜 相差显微镜 40年代制造出来，1953年诺贝尔物理奖 。 特点：能观察无色、透明、活细胞中的细微结构。 优点：不需要对标本进行染色，这就避免了在染色过程中由于化学作用可能引起的标本内部结构的变化。 用途：相差显微镜可用于观察活细胞或未经染色的切片。 暗视野显微镜 原理：暗视野显微镜的聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 丁道尔现象 应用：最适于观察微粒，能够观察到0.004μm以上的微粒存在。还可以观察活体的存在以及活体的运动状态。 荧光显微镜 实体显微镜 用途：立体显微镜主要是用来观察不透明的物体或生物标本的外部形态。 受光源、景深和其它成像因子的影响，放大倍率在60倍以下，解像效果较佳。 三、显微镜的使用与维护： 从低倍镜开始。调焦时，先用粗动手轮将镜筒下降，为了避免物镜压在标本玻片上，可从侧面窥视。 一边从目镜中观察视野，一边利用粗动手轮将镜筒徐徐上升，待初见物像后，改用微动手轮作精细调焦，直至物像最清晰为止。 从低倍镜转换为高倍镜。 使用油镜时将镜筒升高后再转换，最后按低倍镜的调焦方法重新调焦。 显微镜的维护 微调是显微镜机械装置中较精细而又容易损坏的元件，拧到了限位以后，就拧不动了。此时决不能强拧。否则，必然损坏。调焦时，遇到这样情况，应将微调退回3~5圈，重用粗调调焦，待初见物像后，在改用微调。 使用高倍镜观察液体标本时，一定要加盖玻片。 油镜使用后，一定要擦拭干净。 仪器出了故障，不要勉强使用。否则，可能引起更大的故障和不良后果。 第二节激光扫描共聚焦显微镜 Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM LSCM原理 用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。 可以获得样品不同深度层次的图像，对较厚的样本进行无损伤的系列光学切片，得到其各层面的信息。这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的三维立体结构。 LSCM的生物学应用 细胞的三维重建 ：各类细胞骨架形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析 细胞定量荧光测定 细胞内钙离子pH值和其它离子的动态分析 细胞胞间通讯和膜的流动性 第三节 电子显微镜 1932年德国人发明电子显微镜 分辨率：极限分辨率0.2-0.25nm，为光镜的1000倍 透射电镜 （transmission electron microscope ） 超高压电镜 扫描电镜（scanning electron microscope ） 透射电镜 成像原理 透射电镜特点 必须制作超薄切片 7.5-15nm 在真空中进行观察，标本不是生活状态。 电子的穿透能力有限。 與其他分析方法比較，穿透式電子顯微鏡分析是一種破壞性分析。