PDGF-DmiR-106aTwist1信号途径参与吉西他滨耐药肝癌细胞的上皮间质样转换.pdfVIP

PDGF-D/miR-106a/Twist1信号途径参与吉西他滨耐药肝癌 细胞的上皮间质样转换 中文摘要 研究背景与目的： 肝细胞癌 （HepatocellularCarcinoma，HCC，简称 “肝癌”）是一种常见的 消化道恶性肿瘤，起病隐匿，进展迅速，预后较差。全身化疗是晚期HCC重要 的治疗方法之一，耐药仍然是导致治疗失败的主要原因。 鉴于晚期肝癌诊疗现状及耐药的发生，亟待探索新一代细胞毒药物的活性特 点，尤其是获得性耐药的机制。为此，我们实验团队在前期制备了对吉西他滨 （Gemcitabine，GE ）耐药的肝癌细胞HepG2/GE 和Huh-7/GE （以下简称 “HepG2GR”和 “Huh-7GR”）。我们在构建耐药细胞过程中，发现GE 耐 药肝癌细胞发生了上皮间质样转化 （Epithelial-to-mesenchymaltransition，EMT）。 前期研究表明EMT 的发生过程涉及血小板源性生长因子D （Platelet-derived growthfactor-D，PDGF-D）信号通路的异常激活，进一步研究发现微小RNA （MicroRNAs，miRNAs）可能参与调节了PDGF-D介导的EMT。利用PDGF-D 过表达和基因沉默细胞模型，结合miRNAs芯片和生物信息学分析，我们确定 miR-106a可能参与其中，与EMT有关的转录因子Twist1可能是miR-106a 的靶 基因。 基于前期的研究结果，本课题提出 “PDGF-D/miR-106a/Twist1信号途径参 与了吉西他滨耐药肝癌细胞的上皮间质样转换”的学术假说，拟在肝癌亲本和 GE 耐药细胞上，考察PDGF-D对miR-106a表达的调节，分析miR-106a对Twist1 和GE 耐药细胞EMT表型的影响，揭示Twist1与GE 耐药细胞EMT表型之 间的关系。本研究探索了肝癌耐药机制和克服耐药的方法，具有重要意义。 方法： 1.在HCC亲本和耐药细胞上，验证miRNA芯片结果，确定PDGF-D介导的EMT 关键miRNA: 1 在前期研究基础上，进一步完善GE 耐药细胞模型；在HCC亲本和GE 耐 药细胞中分别通过基因转染和siRNA方法导入PDGF-D过表达质粒和沉默 PDGF-D表达，利用miRNA芯片技术筛选差异表达miRNAs。在两个集合中，取 反向调节交集，确定可能参与PDGF-D介导的miRNA （我们确定了miR-106a用于 后续研究）。生物学信息分析Twist1可能是miR-106a的靶基因。 2.在HCC亲本和耐药细胞上，考察PDGF-D与miR-106a和Twist1表达的相关性： 以qRT-PCR测定miR-106a的表达，揭示miR-106a在GE 耐药细胞中是否被广 泛下调；分别以qRT-PCR和Western-Blot方法，测定PDGFD和Twist1的表达。分 析PDGF-D、miR-106a和Twist1表达的相关性。 3.在HCC亲本细胞上，考察PDGF-D过表达对miR-106a和靶基因表达的影响： 在HCC亲本细胞中，以基因转染的方法导入PDGF-D表达质粒来上调PDGF-D 表达。以qRT-PCR方法测定miR-106a表达水平，考察PDGF-D过表达能否下调 miR-106a的表达水平；分别以qRT-PCR和Western-Blot方法，测定Twist1的表达， 考察PDGF-D过表达对Twist1的影响。 4. 肝癌耐药细胞上，考察PDGF-D基因沉默对miR-106a和靶基因表达的影响： 在HCCGR细胞中，以PDGF-D的siRNA瞬时沉默基因的表达。以qRT-PCR方 法测定miR-106a的表达水平，考察PDGF-D瞬时沉默能否上调miR-106a的表达水 平。以qRT-PCR和Western-Blot方法，测定Twist1的的表达，考察PDGF-D瞬时沉 默对Twist1的影响。 5. 在HCC亲本和耐药细胞上，考察miR-106a对靶基因表达和EMT生物学特征的 影响： 在HCC亲本细胞中，转染化学合成的miR-106a阻遏物。以qRT-PCR方法和 Western-Blot方法测定靶基因Twist1的表达，考察瞬时沉默miR-106a能否上调 Twist1的表达。 在HCCGR细胞中，转染化学合成的miR-1