浙大植物生理学报告植物衰老生理.docVIP

实验报告 课程名称：植物生理学实验 指导老师： 成绩： 实验名称：植物衰老生理实验类型: 定量 同组学生姓名： 朱圣日美 一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得 二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤 六、实验结果和分析 实验目的和要求 1.掌握可溶性蛋白测定的原理； 2.掌握植物组织中丙二醛的测定方法； 3.掌握植物组织中超氧物岐化酶（SOD)活性测定方法； 4.了解植物衰老的原理。 二、实验内容和原理 衰老是指细胞、器官或整个植株生理功能衰退，最终自然死亡的过程。 衰老时的生理生化变化:蛋白质显著下降,核酸含量的变化,光合速率下降,呼吸速率下降, 生物膜结构变化, 植物内源激素的变化等。 植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少（可溶性蛋白）。 自由基代谢失调, 并在体内积累膜脂过氧化的产物之一：MDA ①可溶性蛋白测定的原理 考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，溶液的吸收光谱发生变化，从465nm偏转到595nm，并表现出在595nm处的吸收值与溶液中的蛋白质含量有线性关系，其范围从0~1000?g/ml。据此可制作蛋白质的标准曲线，牛血清蛋白为常用的标准蛋白。 待测样品经缓冲液提取后，可溶性蛋白溶于上清液中，蛋白质提取液与考马斯亮蓝G-250反应呈蓝色。测定595nm吸收值，并根据蛋白质的标准曲线，得到样品中可溶性蛋白的含量。 ②MDA测定原理： MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成三甲基复合物，该复合物 最大吸收峰在532nm处；最小吸收峰600nm处 消光系数为155 (mM)-1 cm-1 ③超氧物岐化酶（SOD)活性测定原理： 四氮唑蓝(NBT)光照还原的分光光度法：核黄素受光照产生的O2.-能将NBT还原为蓝色的甲腙，甲腙在560nm波长有最大吸收,而SOD能清除O2.-, 抑制甲腙的产生使吸收减小。通过分光光度检测SOD对O2.-的抑制率,可以表征出SOD含量。 三.实验材料和主要仪器 实验材料：叶龄差异明显的叶片若干 主要仪器：分光光度计，天平，离心机等 四、实验方法和步骤 ①可溶性蛋白测定 （1）制备蛋白提取液 称叶龄差异明显的叶片各0.50g ，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以8000g 离心力作用下（4℃）离心10min，其上清液即为蛋白提取液。 (2) 蛋白标准曲线的制作 蛋白质标准溶液的配制：称取牛血清蛋白（电泳纯）溶于0.15M NaCl溶液中，制成1mg/ml的母液，再用磷酸缓冲液配成各含0、40、80、120、160μg /200ul牛血清蛋白的标准溶液。 考马斯亮蓝G-250蛋白染色试剂的配制 准确吸取0.2ml各含0、40、80、120、160μg牛血清蛋白的标准溶液，分别放入10ml的试管中，加入4.8ml考马斯亮蓝G-250蛋白染色试剂，混合后放置2min，用10mm厚的比色杯在595nm下比色读取OD值，制作通过原点的直线即为其标准曲线。 （3）显色反应 样品的测定： 取40 (l蛋白提取液+160(l磷酸缓冲液于玻璃试管中，加入4.8ml考马斯亮蓝溶液，混匀后放置2min，用10mm厚的比色杯在595nm下比色读取OD值 。对照为空白的磷酸缓冲液加上4.8ml考马斯亮蓝溶液。 ②MDA测定 取上清液1.0ml于7ml离心管中,加TBA与TCA混合液 4.0ml，然后在离心管盖上戳一小孔，92oC水浴保温30min 空白管： 1mL Pi-buffer +TBA与TCA混合液 4.0ml （92oC水浴30min）冷却后，平衡，离心5min; 10000rpm 测定A532, A450和A600 ③超氧物岐化酶（SOD)活性测定 称叶龄差异明显的叶片各1.0g ，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以10000g 离心力作用下（4?C）离心10min，其上清液即为酶提取液。 在暗光条件下加入3mL NBT反应液 和100 μL酶提取液于试管中，在25℃照光（4000-10000lux)并计时,6-25min后出现颜色变化， 9min后测560nmOD值。同时作空白实验。 根据SOD抑制NBT光化学还原的量计算SOD酶活性（unit/gFW)。一个酶活单位相当于引起3mL NBT反应液 达到50%抑制所需要的酶量。测定时用未照光NBT反应液调零。 五、实验数据记录和处理 ①可溶性蛋白测定 标准曲线 显色反应： 叶片种类 OD 新叶 0.183 老叶 0.109 在标准曲线上查得新叶蛋白质量为28.916μ