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（一）DNA连接酶的发现 （二） DNA连接酶作用特点 （三） DNA连接酶的反应条件 （四）DNA连接的策略 二、 DNA连接酶及其应用 * （一）DNA连接酶的发现 环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种 切口的酶存在。 首个DNA连接酶(ligase)——1967年，大肠杆菌DNA连接酶，是大肠杆菌基因编码 。 1970年，发现了T4DNA连接酶 ， 由大肠杆菌T4噬菌体基因编码的。 * （二）DNA连接酶作用的特点 A. 连接的两条链必须分别具有自由3’－OH和 5’－P，而且这两个基团彼此相邻； B. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。 E.coli DNA连接酶 －连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），现在研究可连接平末端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。 T4DNA连接酶－连接具互补碱基黏性末端和平末端， 需ATP辅助因子，活性高，常用。 * 是两条链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。 OH P × × 是相邻的－因此不能封闭gap，只能封闭nick. gap NO Nick OK * DNA 连接酶连接的作用机制 ⑴ E(酶)＋ATP→E－AMP＋ppi E(酶)＋NAD→E－AMP＋NMN ⑵ E－AMP ＋DNA＝DNA－AMP＋E ⑶ DNA上的3’－OH对被活化的磷原子进行亲核攻击，形成磷酸二酯键，同时释放出AMP。 * （三）T4DNA连接酶连接反应的条件 影响连接效率的因素有： A. 温度（通常在4-15℃ ） B. ATP的浓度(10μM／L - 1?M／L ) C. 连接酶浓度（一般平末端大约需1～2U，黏性末端仅需0.1U） D. 反应时间（通常连接过夜） E. 插入片段和载体片段的摩尔比（ 1∶1～5∶1） * （四）T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案 1．连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。 2．10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1～5∶1），补足ddH2O 至8μl。 3．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。 4．加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10μl，稍加离心，在适当温度（一般14-16℃）连接8-14hr。 * 粘性末端DNA片段的连接－DNA连接酶连接法 Nick Nick * 平末端DNA片段的连接－末端同聚物加尾法 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 末端核苷酸转移酶 +dATP +dTTP 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ AAAAA TTTT DNA聚合酶和 T4DNA连接酶 * 平末端DNA片段的连接－衔接物连接法 衔接物(linker)，也叫接头，是有人工化学合成的一段10-12个核苷酸组成，具有有1个或几个限制性酶切位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。 GGATCC CCTAGG + BamHI切割 GATCC G 连接酶＋经BamHI切割的pBR322 G CCTAG BamHI衔接物 dsDNA GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG 连接酶 重组DNA分子 GATCC G G CCTAG * （一）大肠杆菌DNA聚合酶I （二）Klenow片段酶 （三）T4 DNA聚合酶 （四）逆转录酶（反转录酶） 三、DNA聚合酶及其应用 * （一） 大肠杆菌DNA聚合酶I （E。Coli DNA pol I） 是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌E。Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括 3种不同的酶活力： 5′- 3′聚合酶活性 （模板， 带3′－OH游离基团的引物、4dNTPs、 Mg2+ ） 双链特异性的5→3核酸外切酶活性 3→5核酸外切酶活性。 从游离的双链或单链DNA的3′端降解。不过对于双链的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。主要是校正作用。 CCG GGCTATCGGA CCG GGCTATCGGA Pol I + Mg2+＋ 4dNTPs A T A G CCT CCGATAGCCT GGCTATCGGA CCGATAGCCT GGCTA CCGATAGCCT GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ ＋ 4dNTPs CCGATAGCCT GGCTA