基因工程的发展概况.ppt

gpt为细菌来源的谷氨酸-丙氨酸转氨酶基因，用于筛选重组子。 胞浆表达系统 利用脂质体作为基因载体 毒性低、无免疫原性、易制备、稳定性好 四、外源基因表达产物及分离 外源基因在细胞中的表达形式 包涵体 融合蛋白 寡聚型外源蛋白 整合型外源蛋白 分泌型外源蛋白 1、包涵体型异源蛋白的表达 包涵体：外源基因的高表达产物在大肠杆菌中积累，致密地集聚在一起，形成的水不溶性的结构。 正确的氨基酸序列，空间构象错误，通常没有生物学活性。 包涵体本质： 一为折叠状态的外源基因高表达蛋白的集聚作用，形成疏水性颗粒； 二是高度非折叠状态而热稳定性差的外源蛋白的集聚作用，形成高分子量的蛋白多聚体。 优点： 水不溶性，密度大，易于分离纯化。 对蛋白酶有较好的抗性，能在一定程度上保持表达产物的结构稳定。 毒性蛋白以无活性的包涵体形式表达，不会影响宿主菌的生长。 缺点： 无生物活性，需进行变性复性操作 包涵体表达形式的优缺点： 包涵体的溶解与变性 拆开错配的二硫键和次级键。在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中（盐酸胍、尿素等） 包涵体的复性与重折叠: 通过次级键的形成使蛋白质复性； 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠。 将外源基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白为融合蛋白。 2、融合型异源蛋白的表达 N 自身蛋白 裂解位点 外源蛋白 C 优点： 目的蛋白稳定性高 正确折叠，不易被降解，尤其对分子量较小的多肽效果更佳 目的蛋白易于分离 利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析 以融合形式表达目的蛋白的优缺点 目的蛋白表达率高 与受体蛋白共用一套完善的表达元件 溶解性好 由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性。 缺点： 目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段。 采用亲和层析进行纯化 化学断裂法 溴化氰（CNBr），与多肽链中的甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应，其中上游肽段的甲硫氨酸残基转化为高丝氨酸残基，而下游肽段N端的第一位氨基酸残基保持不变。 异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法。 目的蛋白回收方法 酶促裂解法 梭菌蛋白酶 Arg-C 葡萄球菌蛋白酶 Glu-C 假单孢菌蛋白酶 Lys-C 猪胰蛋白酶 Arg-C 构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的蛋白基因串联在一起，克隆在 载体上，以这种方式表达的外源蛋白称为寡聚型外源蛋白。 3、寡聚型外源蛋白 目的蛋白高效表达 稳定表达小分子短肽 目的产物回收困难 寡聚型外源蛋白优缺点： 将要表达的外源基因整合到染色体的非必需编码上，使之成为染色体结构的一部分而稳定的遗传，以这种方式表达的外源蛋白为整合型外源蛋白。 4、整合型外源蛋白 外源基因的表达产物通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基，即为分泌性蛋白。 蛋白产物N端信号肽序列（15-30AA）的存在是蛋白质分泌的前提条件。 5、分泌型异源蛋白的表达 * 蛋 白 质 分 泌 机 制 可能使蛋白质按适当方式折叠； 目的蛋白稳定性高； 简化了发酵后处理的纯化工艺； 目的蛋白末端完整； 真核基因的表达 分泌表达形式的优点： 可能出现的问题 目的基因间连接 载体之间连接 载体的自身环化 目的基因与载体连接 需要检验 2、不同限制酶切位点 优点：载体不能自身环化，重组率高。 平末端连接法 效率显著低于粘性末端 同聚物加尾法 衔接物连接法 DNA接头连接法 同聚物加尾法 利用末端脱氧核苷酸转移酶可催化dNTP 加到单链或双链DNA3’-OH端的能力，在目的DNA和质粒载体上加入互补同聚物，两者再通过互补同聚物之间的氢键作用，形成和转化大肠杆菌的开环重组分子。 按互补粘性片段 进行连接； 10-30个核苷酸； 形成的poly尾不会严格等长，形成的重组体有缺口或裂口。处理方式： 用Klenow大片段酶去填补，然后用DNA连接酶封闭裂口。 注意事项 人工合成的的双链寡核苷酸，一端为平端（与双链目的DNA平端连接），一端为带有某种限制性内切酶的粘