分子生物学（杨建雄）6.DNA的重组和克隆.pptVIP

（1） mRNA的制备 制备mRNA的常用方法是先制备总RNA，经oligo(dT)纤维素柱层析，用高盐缓冲液洗去其它RNA，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱并收集被特异地吸附在柱上的mRNA。对于高丰度的mRNA来说，合成和克隆cDNA之前无需进一步纯化特定的mRNA，而要得到低丰度尤其是极低丰度mRNA的拷贝，就要构建足够大的cDNA文库，或者通过分级分离富集目的mRNA来减少耗资可观、工作量大的建库和筛选工作。要获得高质量的mRNA必须创造一个无RNA酶的环境，在RNA的提取过程中，任何与RNA接触的器皿和溶液都必须做去RNA酶的处理，全部操作过程中都要戴一次性手套并经常更换。 （2） cDNA第一链的合成 来自禽成髓病毒和鼠白血病病毒的逆转录酶均可用于cDNA第一链的合成，前者具RNA酶H活性，最适温度42℃，较高的反应温度可消除mRNA二级结构对逆转录的阻碍作用，但RNA酶H活力会抑制cDNA的合成，限制其长度。后者RNA酶H活力较低，可得2～3kb mRNA的全长cDNA，但要用氢氧化甲基汞破坏mRNA的二级结构，在合成cDNA第一链时，用过量的巯基试剂使氢氧化甲基汞从RNA上解离。用12～18b的oligo(dT)为引物合成cDNA的效率较高，但得到＞3kb的全长cDNA较困难，6b的oligo(dT)为引物可得到较长的cDNA。 （3