分子生物学技术实验报告最终版.doc

组号:NO.2 总得分： 批改教师签字： 年 月 日 实验一 植物基因组总DNA的提取、纯化和鉴定 本实验得分： 批改教师签字： 2014年 6 月 30 日 一、实验目的 掌握CTAB法提取DNA的原理及方法 二、基本原理 植物材料在液氮中研磨可以迅速破坏其细胞壁，游离出细胞器和原生质，并防止DNA降解。采用CTAB抽提液研磨物，在高盐条件下不但溶解细胞膜相物质，而且CTAB与核酸形成可溶性的复合物，采用离心可以将变性的蛋白质和多酚、多糖等杂质去除，水相中含有核酸与CTAB的复合物及其他可溶性的杂质。直接向水相中加入异丙醇使核酸的沉淀，CTAB和其他多数杂质留于与水的混合相中，吸出核酸沉淀团经过多次乙醇漂洗和沉淀，TE溶解得到DNA粗提物。用RNase水解RNA，用酚：氯仿：异戊醇和氯仿抽提去除蛋白杂质等，经乙醇沉淀后可获得高纯度的gDNA。 三、实验材料 甘蓝型油菜幼叶 四、主要仪器设备及耗材 低温离心机、微量移液器、恒温水浴锅、电泳仪及水平电泳槽、紫外透视成像仪等。 五、主要试剂 CTAB抽提液、NaAc（aq）、无水乙醇、异丙醇、β-巯基乙醇、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）、氯仿/异戊醇（24：1）、RNase A(10μg/μl)等。 六、实验流程及步骤 （一）、DNA的粗提 1.向15ml离心管中预先加入5mlCTAB抽提液及0.1ml的巯基乙醇，混匀，65℃预热； 2.称取1.00g油菜幼叶用液氮研磨成粉末，迅速转入1.5ml离心管，迅速摇匀。 3.于65℃水浴45分钟，中途间隔轻柔颠倒混匀3-4次。 4.冷却后加入等体积（5ml）氯仿-异戊醇，轻柔颠倒混匀使乳化10分钟，10000rpm室温离心10分钟。 5.吸取上清于另一干净的15ml离心管中。 6.加入与上清液等体积约（5ml）的异丙醇，颠倒混匀，约1-2分钟后应有白色絮状沉淀出现。 7.将沉淀团移入盛有1ml75%乙醇的离心管中，若沉淀少，则于4℃、1000rpm离心3分钟收集沉淀DNA。 8.在75%乙醇中漂洗沉淀DAN数次，用枪头吸干乙醇。 9.用0.5ml75%乙醇在漂洗2次，连续洗四遍，。 10.无水乙醇再漂洗1次。 11.沉淀于室温或37℃以下的恒温箱中干燥片刻至刚出现透明状，不要过度干燥。 12.用500ulTE溶解沉淀，可用65℃水浴助溶，DNA粗体物可用于粗略PCR等。 （二）、DNA的纯化 1.向TE溶解的DNA粗体物中加入4-10ulRNaseA,约（40-100ug）,轻柔混匀。 2.于65℃酶解RNA 2.5小时，RNA酶分两次加入，每次4ul。 3.加入500μl酚/氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混匀使乳化10min，颠倒1-2min，静置4-5min，重复3次； 5.加入500μl氯仿/异戊醇轻轻颠倒乳化10min；同3 7.向上清中加入1/10体积的醋酸钠溶液，并加入2.5倍体积异丙醇，冰浴沉淀30min； 9.沉淀用75％乙醇500μl漂洗多次；之后用无水乙醇漂洗一次； 七、实验结果与分析 图1 油菜基因组纯化DNA电泳 粗提时DNA清晰抱团，量多，较成功。 纯化DNA电泳条带较暗,没有第五组亮，可能的原因为研磨样品后转管过程中冷粉在管口有少许解冻。 核酸蛋白测定仪测得DNA原液浓度为0.448ug/ul；总DNA重量89.6ug；抽提得率0.0000896；OD260/OD280=1.021.8（可能是因为酚/氯仿/异戊醇变质氧化成粉色而效果不佳，使蛋白质去除不彻底）； OD260/OD230 =0.5421.8（可能是因为乙醇清洗不彻底） 八、讨论 1．在DNA粗提过程中，CTAB应注意提前在65℃水浴中预热，有助于DNA的抽提；在材料研磨过程中应注意研磨破碎，快速转管，防止材料解冻；基因组DNA一般比较大，为防止断裂，应避免剧烈震荡。 2.在 DNA纯化过程中，出现白色凝胶状，其原因可能是材料含糖量过高，导致其在电泳过程中与DNA吸附在一起，无法跑出条带，在65℃酶解RNA 时间可以适当延长，保证RNA彻底降解。造成纯化失败的原因包括以下几个因素：植物材料多糖含量较高，与DNA粘附在一起，停留在点样孔；在DNA粗提过程中可能由于酚：氯仿：异戊醇试剂出现质量问题，导致纯化失败；粗提的DNA应选择P H8.0以上的TE溶解，使DNA在碱性条件下保存。 3．磨样转管过程不能升温解冻，一直保持冷粉状态。 实验二 目标基因的PCR扩增、电泳鉴定和胶回收 本实验得分： 批改教师签字：