有机实验 9、实验八：有色物质的柱层析.docxVIP

实验四 有色物质的柱层析 ?一、实验目的： 掌握柱层析的基本操作技能，通过柱层析进一步理解层析法分离、提纯有机化合物的基本原理。 二、实验原理： 柱层析一般分为吸附柱层析和分配柱层析两种，吸附柱层析常以氧化铝和硅胶作为固定相；分配柱层析以硅胶、纤维素等为支持剂，以其吸收大量液体作固定相，支持剂本身不起作用。我们仅介绍吸附柱层析。 吸附柱层析是利用固定相对混合物中各组分吸附能力的不同加以分离的方法。固定相常为氧化铝和硅胶，它们是很细的固体颗粒，对不同极性的化合物吸附能力不同，极性大的化合物吸附力大；极性小的化合物吸附力小。当有溶剂流经固定相时，吸附力小的化合物先从被吸附的颗粒洗脱，接着又被新的颗粒吸附，再洗脱，再吸附，经过无数次的吸附洗脱过程，极性不同的组分可分离开来。 本实验由于偶氮苯的极性较邻硝基苯胺小，Al2O3对前者的吸附力较小，我们先用极性较小的洗脱剂（石油醚：乙酸乙酯=20:1），将偶氮苯洗出，再用极性较大的洗脱剂（乙醇）将邻硝基苯胺冲下。从而将两个化合物分离。 层析硅胶种类：普通硅胶：200-300目（用于柱层析）；硅胶H：500目（用于减压柱层析）；硅胶G：含13%煅石膏粘合剂；硅胶HF254：含254荧光的硅胶H；硅胶GF254：含254荧光剂的硅胶G；CMC：羧甲基纤维素钠；F254：硅酸锌+3%锰活化。 三、试剂和仪器 氧化铝Al2O3 石油醚 乙酸乙酯 无水乙醇 层析柱 1根 50 ml三角瓶 4个 100 ml量筒 1个 薄层层析板 四、实验步骤 1、装柱[1] 将层析柱垂直放置，如图湿法装柱流程，在柱的下端放一接受瓶，现在柱中加入2 ml石油醚，取少许棉花放入柱的底部[2]，称取5克Al2O3置于50ml的干燥烧杯中，加入10-15 ml石油醚[3]，用玻璃棒搅匀，边搅拌边倒入层析柱中，待Al2O3静置后，打开层析柱的活塞，放掉多余的石油醚，使石油醚液面稍高于Al2O3平面。 2、加样 打开层析柱活塞，使石油醚液面降至几乎与Al2O3平面相平，关闭活塞。滴加两滴样品溶液，打开活塞使液面与Al2O3平面相平，加入少许Al2O3[4]。 3、洗脱 向层析柱中小心加入洗脱液21ml（石油醚：乙酸乙酯=20:1），打开层析柱活塞，棕红色的偶氮苯色带因极性小，慢慢与极性较大的黄色邻硝基苯胺色带分离。当棕红色色带前沿到达层析柱底部时，更换一个接收瓶，接受红色色带[5]。当红色色带流尽时，改用乙醇作洗脱剂，将黄色的邻硝基苯胺冲下，接收到另一个接受瓶中。 4、薄层层析 将上述接收液，分别点样于硅胶板上，用石油醚：乙酸乙酯=20:1的展开剂展开，观察分离效果，计算偶氮苯及邻硝基苯胺的Rf值[6]。 注意事项： [1]、柱层析分离效果的好坏取决于装柱的好坏。装柱方法有干法装柱和施法装柱两种。所谓干法装柱就是将固定相直接导入层析柱中，并轻轻敲击层析柱，以使柱子装填比较均匀，装充完毕，再用层析洗脱液洗脱柱子，以赶尽柱中的气泡；所谓湿法装柱是将固定相与洗脱剂调成浆状，然后倒入柱中，让固定相自由沉降而填实。湿法装柱，柱中不易留有气泡，装填比较均匀，对于初学者来说是最好的装柱方法。若柱中有气泡、裂缝，会降低柱子的分离效果。 [2]、装柱时先加入石油醚，再加棉花，是为了赶尽柱底部的气泡。否则，易在棉花底部留有气泡。棉花塞的不要太紧，否则，洗脱液滴速会很慢。 [3]、可先用10 ml，再用5 ml把剩余的Al2O3转移到柱中，石油醚可以重复使用。 [4]、加入Al2O3的??的是为了防止在加洗脱剂时，样品被冲起来，也可以加入石英砂或加一合适大小的纸片。 [5]、偶氮苯有顺、反两种构型，由于两种构型的极性不同，顺式的极性比反式大，故有时分为两个色带，前面色带为反式偶氮苯色带；后面的色带为顺式偶氮苯色带。 [6]、Rf值：一个化合物在薄层板上上升的高度与展开剂上升高度的比值。 五、思考题 1、本实验分离两个化合物的依据是什么？、 2、若柱中留有气泡或填充不均匀，会怎样影响分离效果？如何避免？ 3、薄层层析时，若加入展开剂的量没过样品斑点将会有什么后果？