老碾尿素通道蛋白基因敲除鼠急性缺氧耐受能力下降的研究.docVIP

　　老碾尿素通道蛋白基因敲除鼠急性缺氧耐受能力下降的研究 作者：周磊 孟艳 苏静 杨宝学 赵雪俭 【摘要】 目的 探讨老年尿素通道蛋白B（UTB）基因敲除鼠与老年野生鼠对急性缺氧耐受力的差异，并探讨其发生的可能机制。方法 小鼠的DNA提取及其PCR基因型鉴定；2 mol/L尿素溶血实验；急性缺氧实验；心肌超微结构观察。结果 通过2 mol/L尿素溶血实验发现UTB敲除后红细胞对于高浓度尿素的抵抗性增高；急性缺氧实验发现老年UTB基因敲除鼠对急性缺氧的耐受力明显降低（P＜0.05）；心肌超微机构观察显示UTB基因敲除鼠线粒体数目减少，排列紊乱，界限不清，嵴肿大或消失。结论 老年UTB基因敲除鼠对于急性缺氧的耐受力下降可能是由于UTB基因的敲除影响了红细胞及心肌线粒体的完整性及功能。 【关键词】 UTB；缺氧；线粒体 红细胞膜和肾集合管末段对尿素的通透性远远高于脂相单纯扩散,提示尿素跨膜转运由尿素通道蛋白( urea tansporters，UTs) 介导〔1〕。1994年又从人骨髓中分离出了另一个UTs家族成员UTB的cDNA 。至今被克隆的UTs 包括两个家族,肾小管型UTA 和红细胞血管型UTB。Northern印迹法分析人和大鼠组织发现,UTB的mRNA 分布广泛。UTB在红细胞和肾脏髓质降直小血管高表达，并广泛分布于心脏、骨骼肌、结肠、小肠、脑、胸腺、前列腺、肝脏、卵巢、肾盂、膀胱中〔2，3〕。本实验室Yu等〔4〕对比观察了6、16、52 m，剪碎加入消化液20 μl（100 mmol EDTA，10 mmol TrisCl pH8.0，0.5% SDS，100 μg/ml蛋白酶K），55℃水浴2 h，加入200 μl蒸馏水，100℃水浴5 min，16 000r/min离心1 min，弃沉淀，余上清即为DNA。基因型鉴定引物：上游引物(S)：5′GGATCTGCCTTCCAAGAAACTCGTGTC3′;下游引物1(AS1)：5′GTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACC3′；下游引物2(AS2)：5′CAGGCCAGAGGGACAGCACAAACA3′。上游引物与下游引物1、2配成两重PCR反应体系，其中AS1产物400 bp，AS2产物280 bp。一份DNA样本如果只能扩增出产物400 bp，提示其有正常的UTB基因，为UTB 野生型鼠（+/+）；如果只能扩增出产物280 bp，提示其为UTB敲除纯合型鼠（/）；如既扩增出的产物1同时具有400 bp和280 bp两条产物带，提示其为UTB杂合型鼠（+/）。 1.3 2 mol/L尿素溶血试验 24孔培养板中加入2 mol/L尿素溶液600 μl，取鼠抗凝静脉血1 μl加入尿素溶液中，倒置显微镜观察0、1、4、10 min时红细胞的形态变化与溶血过程，拍照记录。以生理盐水替代2 mol/L尿素溶液作为阴性对照。 1.4 急性低张性缺氧实验 实验鼠均为雌性，52 l磨口烧瓶中进行，瓶口用石蜡油密封，瓶内装30 g碱石灰，直到鼠缺氧死亡。 1.5 观察心肌超微结构形态改变 取心肌组织于3%戊二醛中固定，再以1%锇酸固定，在H600 电子 显微镜下观察心肌超微结构。 1.6 结果统计 本实验数据均采用x±s表示，应用SPSS 11.0统计软件包处理。 2 结 果 2.1 基因型鉴定 见图1。PCR鉴定结果显示UTB敲除纯合型在280 bp出现条带，野生型（+/+）在400 bp出现条带，杂合型（+/）在400 bp和280 bp同时出现两个条带。 图1 PCR鉴定小鼠UTB基因型 2.2 生存时间 如图2所示,敲除纯合子生存时间少于野生型（P＜0.05）。 图2 急性缺氧小鼠存活时间 2.3 心肌细胞超微结构改变 见图3。野生组的心肌细胞线粒体排列整齐，数目较多，嵴正常。UTB/组可见线粒体数目减少，排列紊乱，界限不清，嵴肿大或消失，基质密度减低。 图3 心肌细胞超微结构观察 2.4 2 mol/L尿素溶血实验 UTB+/+小鼠及UTB +/小鼠的红细胞加入2 mol/L尿素溶液后，均在1 min之内溶血(图4 E)，无差异，提示小鼠红细胞对尿素通透性高，表现正常溶血反应。UTB/小鼠的红细胞在2 mol/L尿素溶液中，1 min时细胞的体积无变化(图4B)，如在0.9％NaCl溶液中(图4A)，但数量开始减少；4 min时细胞体积开始膨胀，数量进一步减少(图4C)；随着时间延长，8 min时视野中只剩极个别细胞(图4D)，10 min左右细胞在视野中消失，提示UTB敲除型小鼠的红细胞对尿素渗透性低，对高浓度尿素溶血具有抵抗性。