腺苷预适应对心肌的延迟保护研究.docVIP

　　腺苷预适应对心肌的延迟保护研究 作者：丁家望 杨俊 李松 李稳慧 李莉 姜玉蓉 陈勇 【摘要】 目的 旨在证实ATP敏感性钾通道（KATP）的开放和内源性一氧化氮合成酶（iNOS）表达上调介导了腺苷(ADO)预处理的延迟保护。方法 实验动物随机分成4组，对照组：心肌缺血前24 h静注生理盐水；ADOA1受体激动剂（CCPA）组：心肌缺血前24 h静注CCPA进行药物预处理；格列苯脲（Gli）组：心肌缺血前30 min静注Gli；CCPA/Gli组：在CCPA组处理的基础上，心肌缺血前30 min静注Gli。采用家兔离体工作心脏模型，各组心肌均缺血30 min，复灌30 min。观察缺血/再灌注前后血流动力学和心功能变化。测定再灌注后冠脉流出液乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CPK）、一氧化氮(NO)和心肌组织三磷酸腺苷（ATP）含量。用氯化三苯基四氮唑(TTC)判断心肌梗死范围。逆转录酶链聚合法测定iNOSmRNA。结果 ①CCPA预处理明显改善心肌缺血/再灌注后心功能的恢复，且这种保护作用被Gli阻断；②CCPA预处理减少心肌缺血/再灌注后冠脉流出液LDH、CPK含量，且Gli可抑制这种保护效应；③CCPA预处理可缩小心肌梗死范围，且被Gli阻断；④CCPA预处理可增加心肌组织ATP浓度，Gli可拮抗这种保护作用；⑤CCPA预处理轻度提高心肌组织NO浓度，此效应不受Gli影响；⑥CCPA预处理上调心肌组织iNOS表达，此效应不受Gli拮抗。结论 iNOS合成的NO通过激活KATP介导ADO预处理的延迟保护效应。 【关键词】 腺苷受体；再灌注损伤；延迟保护 心肌短暂缺血后不仅具有即刻的保护作用，同时具有延迟保护〔1〕。腺苷(ADO)及其受体参与了预处理的早期保护作用，同时也是延迟保护的重要介质〔2〕。KATP阻滞剂5羟基癸酸(5hydroxydecanoate，5HD)可以拮抗ADO预处理带来的心肌保护作用〔3〕。KATP是单磷酰脂A(MLA)预处理诱导心肌延迟保护的主要内在机制。本文拟利用外源性ADO A1受体激动剂预处理家兔以模拟缺血预处理的心肌延迟保护效应，探讨ADO预处理心肌延迟保护的受体后机制。 　　 1 材料与方法 　　1.1 主要材料与试剂 　　清洁级家兔48只，体重2.5～3.5 kg，雌雄不限。ADOA1激动剂2氯6氮环戊烷基ADO(CCPA) (美国Simga公司)；Trizol RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)；RTPCR按照试剂盒(日本TaKaRa公司)；PCR引物购自Promega公司；其他试剂均为国产分析纯。Nean公司；LKB1251生物发光仪和可见紫外分光光度计，上海分析仪器厂。 　　1.2 动物模型 　　耳缘静脉注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)将兔麻醉后，用肝素500 U/kg抗凝。迅速开胸取出心脏置入改良KrebsHenselert液中，行主动脉和左心房插管，置于灌注架上，以95%O2和5%CO2饱和的KrebsHenselert液经主动脉行Langendorff逆行灌注，温度37℃，灌注压10 kPa。经左心室壁插入压力探头，经压力换能器连接于多道生理记录仪。 Langendorff灌注10 min 后转为工作心状态，即经左房灌注(压力为1.995 kPa)。平衡灌注15 min后，钳闭左心房插管造成全心缺血30 min，然后恢复灌注30 min。灌注完毕，心脏以及再灌注30 min时冠脉流出液标本置-70℃保存。 　　1.3 实验分组 　　实验动物随机分为4组：对照组(n=12)：心肌缺血/再灌注24 h前静注生理盐水0.5 ml作为对照；(2)CCPA组(n=12)：心肌缺血/再灌注24 h前静注CCPA(0.1 mg/kg)作为药物预处理；Gli组(n=12)：心肌缺血/再灌注开始前30 min静注Gli(0.3 mg/kg)；CCPA/Gli组(n=12)：CCPA预处理(同第二组)的基础上，在心肌缺血/再灌注开始前30 min静注Gli(0.3 mg/kg)。灌注结束后，各组取6只家兔用于心肌梗死范围测定，另6只用于其他观察指标的测定。各组于平衡灌注15 min时测定血流动力学指标作为基础值，测定再灌注末相关指标为实验值。 　　1.4 观察指标 　　1.4.1 血流动力学参数测定 　　心脏跳动稳定后，记录心率(HR)、冠脉流量(CF)、心输出量(CO)、左心室舒张期末压(LVEDP)、左心室收缩期峰压(LVSP)。以停灌前工作心功能基础水平为100%，比较复灌末心功能恢复的百分率。 　　1.4.2 心肌梗死范围测定 　　灌注结束后，从左心室导管推注2%～3%Evans蓝2～3 ml，2 min后迅速取下心脏，分离缺血区(无蓝色