质粒的亚克隆和连接.docVIP

质粒的亚克隆和连接 1)进行一次成功的连接实验需要优化哪些实验指标？2)为保证亚克隆实验成功需作哪些对照实验？3)为检测感受态细胞的效果需作哪些对照实验？4)为检测连接反应的效果须作哪些对照实验？5)为检测磷酸酶处理的效果须作哪些对照实验？6)进行T-克隆时，有哪些特殊的要求？7)什么是蓝/白斑筛选，怎么进行蓝/白斑筛选？8)筛选合适的宿主菌株应考虑哪些因素？9)除蓝/白斑筛选外，还有哪些方法可用于筛选重组菌落？--------------------------------------------------------------------------------1)进行一次成功的连接实验需要优化哪些实验指标？进行一次成功的连接实验需要优化一系列实验指标。A）载体和插入片段的摩尔浓度比特别重要，载体：插入片段的摩尔数的变化范围可为8：1到1：16，但通常的变化范围是3：1到1：3。插入片段的长度和序列的变化会影响和同一载体的连接效果。每一个连接反应都需要作实验，来选择最佳的载体和插入片段的摩尔数比。在最小的反应体积中，通常一个连接反应用10-50ng的载体DNA。B）进行连接反应时的保温的时间和温度也需优化。一般而言，平末端连接在22oC保温4-16小时，粘性末端在22oC保温3小时，或4 oC保温16小时。大多数连接反应用T4DNA连接酶，但大肠杆菌的DNA连接酶可用于粘性末端的连接，平末端连接时用此酶，活力较低。每次连接反应用1-10Weiss单位的高质量连接酶。更多的资料参阅T4DNA连接酶产品插叶 #9PIM180。C）用于转化连接反应液的细菌菌株，以及用于重组质粒扩增的菌株，需经挑选，细菌生长的温度也要挑选。当用pGEM载体克隆大片段时（7-8kbp），经转化的菌株在30 oC而不是在37 oC生长，更有利于连接。作简单的亚克隆连接实验，亚克隆转化效率的感受态细胞就可满足克隆需要，更高转化效率的感受态细胞可用于作比较困难的克隆实验。为提高获得目的克隆的机会，应用尽可能高转化效率的感受态细胞（10（8次方）克隆/ugDNA）。筛选重组克隆时，需选择抗菌素的浓度。表1给出了常用抗菌素和常用工作浓度的范围。—————————————————————————————————————————— 氨卞青霉素(Amp)， 工作浓度50-100ug/ml，??贮液浓度 50mg/ml(水)氯霉素(Cm)，??????????工作浓度20-170 ug/ml， 贮液浓度 34mg/ml(乙醇)卡拉霉素（Kan）， 工作浓度 30ug/ml，??????贮液浓度 50mg/ml(水)链霉素（Sm），???? 工作浓度30ug/ml，????????贮液浓度 50mg/ml(水)四环素（Tet），????工作浓度10ug/ml用于液体，12.5ug/ml用于固体， 贮液浓度12.5mg/ml(乙醇)_____________________________________________________________________________________D）为降低背景，提高插入片段的连接效率，载体用单一限制性内切酶切割后，需去磷酸化。这可提高插入片段的连接效率，抑制载体自身连接。为使连接成功，载体和插入片段应纯化无杂质。残留的杂质会干扰连接酶的效果，抑制连接反应。Wizard PCR Prep(目录号A7170)和DNA Clean-Up(目录号A7280)可在连接前用于将载体和插入DNA的纯化。2)为保证亚克隆实验成功需作哪些对照实验？为使亚克隆实验成功，并能在未获得目的克隆时，查明实验失败的原因，每次实验应包括相应的对照。其中包括：感受态细胞的转化效率抗菌素是否有效连接的效率未连接质粒的背景磷酸酶处理的效果在以下一些问题解答中对这些对照实验作了进一步的解释。3)为检测感受态细胞的效果需作哪些对照实验？为保证宿主细胞是感受态细胞，而且无污染，需作3个试验。取1管分装的感受态细胞，不作转化（比如不加DNA，但和实验样品平行处理），将等量的细菌涂布到含抗菌素和不含抗菌素的平板上。含抗菌素的平板应无菌落生长，生长有菌落就表明污染了质粒或抗菌素失效，为区别可从生长的菌落中提取质粒，以鉴别原因。不含抗菌素的平板上应生长了许多菌落，甚至菌落群，反之表明细菌无活力。第3个实验是确定感受态细胞的转化效率。将一定量的完整质粒转化到感受态细胞中，取一部分转化的细菌，涂布到选择培养基上，可用菌落生长单位/ugDNA，按下面的方法计算感受态细胞的转化效率：用0.1ng完整的质粒DNA转化100ul的感受态细胞，向转化反应液中加入900 ul培养液（0