WesternBlot相关实验操作指南.docVIP

Western Blot相关实验操作指南 (本实验相关试剂配方详见附件) 制胶: 清洗玻璃板，绿色玻板夹，梳齿。 将洗净的玻璃板左右对齐，放入绿色玻板夹中轻放于桌面使玻璃板底部对齐将两侧扇片同时夹紧，放于制胶架上，灌水检漏。 根据需要选择不同浓度的分离胶，按蛋白质室的配方配置分离胶，一块分离胶5ml体积，用10ml离心管配制。TEMED最后加入，快速摇匀后立即用1ml移液枪灌胶，动作轻缓避免产生气泡，每加一枪不要全部打完枪头留一部分液体然后吸下一枪继续灌胶可以避免打入气泡，胶面灌至绿条下方1-2mm处即可，若稍漏可根据漏出体积适量多加一些，灌好胶后立即用移液枪贴内侧玻板左右移动加入ddH2O液封，动作要轻避免胶被冲起。 静置约30min待胶充分凝固（此时水胶之间可见折线），轻轻胶倒掉上层的水，用吸水纸将残余的水吸干。 根据蛋白质室配方配浓缩胶，一块胶2ml体积，用5ml离心管配置，迅速摇匀后在分离胶上方灌入浓缩胶，灌胶至顶部后立即插入梳齿，避免气泡（若有气泡可用梳齿或枪头轻轻拨开后再插入梳齿）。 待凝胶后，取下玻璃板放入电泳槽加入适量WB电泳Buffer以备后续上样操作。（若制好胶后有特殊情况不能立即进行上样，可以取大平皿装适量ddH2O或WB电泳Buffer将玻璃板浸泡其中4℃保存，也可以用保鲜膜或一次性手套将玻璃板包裹起来4℃保存）。 上样： 蛋白样品上样量一般为每孔50ug-100ug为宜，上样量不宜过高，否则条带一大坨不好看。上样体积15孔胶一般10ul为宜建议不超过15ul，10孔胶一般15ul为宜建议不超过25ul。 上样前蛋白样品用PBS稀释，并加入5X Loading Buffer。例如测得蛋白样品A的浓度为9.3ug/ul，以50ug上样则每孔上样体积为50÷9.3=5.38ul，按每孔10ul体积上样则5.38ul 蛋白样品 + 2.62ul PBS + 2ul 5X Loading Buffer =10ul加入PCR管中，离心置于PCR板上，待所有样品准备完毕一起上样。 （注：由于5X Loading Buffer很粘稠直接加入容易吹出气泡，可以把枪头贴壁先将其打到PCR管壁，再用小离心机将其离下去与下方的蛋白和PBS混匀。） 轻轻拔掉玻璃板上的梳齿，在小电泳槽中倒入WB电泳Buffer液面应略高于点样孔，用10ul移液枪将蛋白样品吸起，加入到点样孔中，根据样品分布在适当的位置选取一个点样孔加入5ul彩色预染marker，若两侧还有空余的孔，则用10ul 1X Loading Buffer补齐。 上样完成后在外侧大电泳槽中放入2个冰袋，倒入适量的回收的WB电泳Buffer（推荐在大电泳槽中倒入约4/5高度的回收WB电泳Buffer，以刚好高于点样孔为宜），盖上电泳槽盖子，连接好电源线正负极，准备电泳。 电泳： 恒压：浓缩胶 80 V 分离胶 100V 恒流：浓缩胶 10mA 约30min 分离胶 15mA或25mA 约60min （电流越大跑得越快,可根据自身实验调节时间） 蓝色条带跑到底部是即可停止电泳，电泳完后将WB电泳Buffer回收，清洗电泳槽放回原位，取出玻璃板以备后续的转膜实验。 转膜： ⑴半干转：一般适用于小于100kDa的蛋白（4楼转膜仪） 所需用品：2个大平皿（一个装甲醇，一个装ddH2O），镊子，小铲子，甲醇，转膜Buffer，厚滤纸2片/每块胶，PVDF膜，玻璃板（即电泳完的胶）。 操作步骤： 根据胶的大小剪取相应大小的PVDF膜，（一整块胶大约8×5个田字格大小）用镊子将膜夹于甲醇中激活1min，然后放到ddH2O中清洗一下，正反两面都要洗，置于含有ddH2O的平皿中备用。 回收甲醇，然后在平皿中倒入适量的转膜Buffer，将玻璃板在转膜Buffer浸泡一下使胶湿润避免撬起时裂开，用小铲子将玻璃板轻轻撬开，切去多余的胶，并在右上角切角做好标记。然后用小铲子将胶轻轻移至含有转膜Buffer的平皿中，同时将用ddH2O清洗好的PVDF膜用镊子夹取到含有转膜Buffer的平皿中，注意此时膜和胶不要重叠到一起，备用。 将两片厚滤纸放入转膜抽屉中，倒入100-200ml转膜Buffer将滤纸浸湿用小滚筒将滤纸表面压平，从下往上按照滤纸—PVDF膜—胶—滤纸的顺序将膜和胶依次放到滤纸上并用小滚筒除去气泡，将另一滤纸放到最上层，盖上转膜抽屉的盖子锁紧旋钮，倒掉一些多余的转膜Buffer，在抽屉里留一点即可。 将转膜抽屉放入转膜仪中，按照仪器自设的标准转膜程序转膜20-30min。 ⑵湿转：一般适用于大于100kDa的蛋白 所需用品：参照半干转。 操作步骤：（大部分与半干转相同，故仅写出简略步骤） 1