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uplc实验步骤 篇一：UPLC-MSMS应用 采用UPLC-MS/MS测定大鼠血浆中的咖啡因、甲糖宁、美托 洛尔、氨苯砜以及在P450酶活性研究中的应用 摘要：超高效液相色谱（UPLC）串联质谱（MS）的方法可以用来检测大鼠血清中细胞色素P450同工酶CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4的四种探针药物咖啡因、美托洛尔、甲糖宁和氨苯砜。实验中，采用Waters公司的超高效液相色谱（C18，2.1×50mm， 1.7μm），流动相体积比为15:85的乙腈和水（含0.1%的甲酸）；三重四级杆质谱采用电喷雾离子化的操作方式；内标物为非那西丁；采用体积比为10:1的二氯甲烷和丁醇来萃取血浆样品。回收率变化范围从67.5%到98.5%。四种药物标准曲线的线性范围和相关系数（r2）分别是：咖啡因：2.5ng/mL—1000ng/mL，0.9936；氨苯砜：2.5ng/mL—1000ng/mL，0.9966；甲糖宁：5ng/mL—5000ng/mL，0.9990；美托洛尔：2.5ng/mL—250ng/mL,0.9998。实验中，这种方法成功的应用到了对四种探针药物的研究和对灯盏花素与四种P450同工酶作用效应活性的评价。 关键词：UPLC-MS/MS；细胞色素P450；活性评价 1、引言 细胞色素P450超家族是一个主要的药物代谢酶系，在内源性和外源性物质的代谢或生物转化中起着重要的作用。为了能够避免可能的药-药相互作用和药物不良反应的风险，确定药物是否对P450酶的活动造成影响是相当重要的。CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4是CYP450的四个主要亚型，代谢目前90%以上的药物。咖啡因、甲糖宁、美托洛尔和氨苯砜分别是CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4的探针药物，它们常常用来检测这些同工酶的活性。如果这四个探针药物在给药和测定时间分别 一样，那么这些同工酶的活性就能同时被评价。跟传统的单探针方法比较，“鸡尾酒”方法在一个实验中能够同时评价超过一个CYP450的同工酶的活性，并且能尽量减少个体的差异；同时，此方法更方便、快捷。应用高效液相色谱（HPLC）对多个探针药物进行同时测定的方法，在早期的出版物中也有描述，但是很难达到理想的分离效果，并且耗时、需要梯度洗脱。因此有必要开发一种快速、可靠的方法。本实验提供了一种在一次实验利用超高效液相色谱与质谱联用（UPLC-MS/MS），同时测定大鼠血浆萃取剂中四种探针药物的方法。 灯盏花素是一种传统的中草药，广泛的应用于对脑血栓、脑出血、冠状疾病等的治疗。时至今日，有许多CYP450介导的中草药-药的药物相互作用被报道。临床上，灯盏花素通常被用于与CYP450的底物结合，但是我们不知道灯盏花素是否对CYP450产生效应。为此，我们研究了在大鼠体内灯盏花素是否对CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4的产生效应。结果显示，灯盏花素对CYP1A2的活性有诱导作用，对CYP3A4的活性有抑制作用，对CYP2C9和CYP2D6的活性没有什么大的影响。 2、实验 2.1试剂和材料 咖啡因、美托洛尔、非那西丁（国家制药和生物制品控制研究所）；甲糖宁 （Ehrenstorfer博士）；氨苯砜（西格玛）；灯盏花素注射液（5mg/mL，昆明制药）；甲醇、甲酸（HPLC级）；探针药物混合液（含适量聚山梨醇酯80） 2.2仪器 UPLC-MS/MS（Waters）；ESI源；软件MassLynxTM V 4.1（Waters） 2.3色谱条件 C18柱（2.1×50mm，1.7μm）；柱温40℃；室温10℃；流动相乙腈/水（含0.1% 甲酸）=15:85；流速0.25mL/min；运行时间5min 2.4质谱条件 电离条件：毛细管电压3.3kV；锥孔电压30V；离子源温度120℃；干燥气体（N2）温度350℃（650L/h）；锥孔气体流速50L/h。碰撞能量：氨苯砜、咖啡因24eV，甲糖宁32eV，美托洛尔、非那西丁20eV。MRM模式（电压变换范围分别为：咖啡因195→138、甲糖宁271→91、美托洛尔268→116、氨苯砜249→92、非那西丁180→110） 2.5样品制备 分别取20μL四种探针药物于一离心管，用氮气在40℃下吹扫干燥。然后取20μL内标液和1000μL空白血浆液于一离心管中，涡旋振荡3min。用2.0ml乙腈/水（10:1，v/v）萃取血浆样品，涡旋3min，离心（5000g）5min后有机相转移到另一离心管中，在40℃水浴下蒸发干燥样品。用200μL的流动相再次萃取残留液。最后，取10μL进样到UPLC-MS/MS中。 2.6标准曲线和质控样品的制备 所有分析物的储备液用甲