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第二十章 高效液相色谱法 高效液相色谱法概述 高效液相色谱法 HPLC （high performance liquid chromatograph） 高压输液泵 高效固定相 高灵敏度检测器 高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较 见表 高效液相色谱法与GC的比较 见表 高效液相色谱法的 分类与基本原理 20.2.1 高效液相色谱法的分类 按固定相的聚集状态： LLC和LSC 按分离机制： 分配、吸附、离子交换（IEC）、空间排阻（SEC）、亲合（AC）、手性（CC）、胶束（MC）、电色谱法（EC）。 20.2.2 高效液相色谱法的基本原理 HPLC的范氏方程： 讨论： 涡流扩散项：填料和填充均匀程度 纵向扩散项 传质阻力项 综上所述，HPLC应采用： 1)采用小粒径、窄粒度分布的球形固定相，首选化学键合相，用均浆法装柱； 2）采用低粘度流动相，低流速（1ml/min)； 3）柱温一般以25～35度为宜。太低，则流动相的粘度增加，温度高易产生气泡。 流速 各类高效液相色谱法 20.3.1 液－固吸附色谱法 分离机理 溶质分子与流动相分子竞争吸附吸附剂表面吸附活性中心，靠溶质分子的分配系数（容量因子）不同而分离。 影响容量因子的因素 溶质分子的极性 溶剂的极性 硅胶的活性 20.3.2 液－液分配色谱法 分离机理 靠样品组分溶入固定相与流动相达到“平衡”后分配系数的差别而分离。 正、反相液－液色谱法 注意流出顺序。 目前，物理涂渍的液－液色谱几乎已被化学键合相所取代。 20.3.3 化学键合相色谱法 将固定液的官能团键合在载体表面，就构成化学键合相。以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱法（bonded phase chromatograph，BPC） 化学键合相的优点 均一、稳定；不易流失，使用周期长；柱效高；重现性好。 反相键合相色谱法（RBPC或RHPLC） 固定相：在载体表面键合含弱极性或中等极性的基团，如十八烷基硅烷（C18）（ODS柱）、辛烷基（C8）、甲基（－CH3）、苯基等。 流动相：以水做主体，加适量的极性调节剂增加选择性如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。 出峰顺序： 极性强的组分先出柱，极性弱的组分后出柱。 影响保留时间的因素： 溶质的分子结构： 极性越弱，保留时间越长。 流动相的表面张力、介电常数和pH值： 对于二元或多元体系改变溶剂的配比可改变流动相的表面张力和介电常数。通常，流动相中有机溶剂含量增加，k变小。 正相键合相色谱法 固定相：在载体表面键合含中等极性或较强极性的基团，如氰基（－CN）、氨基（—NH3）、或二羟基等。 流动相：以非极性或弱极性的溶剂如己烷、庚烷等为主体，加适量的极性调节剂增加选择性如乙醚、氯仿、二氯甲烷等。 出峰顺序： 极性弱的组分先出柱，极性强的组分后出柱。 影响保留时间的因素： 键合相的种类、流动相的强度、试样的性质。 流动相的极性增强，洗脱能力增加，保留时间缩短。 适应范围： 分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物。 反相离子对色谱法（RPIC） 离子对色谱法的适用对象： 用于有机酸、碱、盐的分离，以及用离子交换色谱法无法分离的离子型和非离子型化合物的混合物的分离。 离子抑制色谱法 （ion suppression chromatograph，ISC） 在反相色谱法中，通过向流动相加入少量弱酸（常用乙酸）、弱碱（常用氨水）或缓冲盐（常用磷酸盐及乙酸盐）来调节流动相的pH，抑制样品组分的离解，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法。 调节pH范围：2～7.5 pH8.0 破坏键合相与载体的结合 pH2.0 腐蚀柱子 离子抑制色谱法适用：弱酸碱