第五讲 DNA的提取原理及提.ppt

CTAB法（植物DNA提取经典方法） 原理： CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 * 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀。 通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。 * CTAB提取缓冲液的配方 组份 Tris-HCl （pH8.0） 　EDTA （pH8.0） NaCl CTAB β-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 1.4M 2%(W/V) 0.1%（V/V）使用前加入  Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； Tris (三羟甲基氨基甲烷 ) EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 * CTAB提取缓冲液的改进配方  组份 Tris-HCl （pH8.0） 　EDTA （pH8.0） NaCl CTAB PVP40 β-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 1.4M 3%(W/V) 5%(W/V) 2%（V/V）使用前加入 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 * CTAB法提取植物DNA的操作步骤 1 称取2～5g新鲜菠菜幼嫩组织或小麦黄花苗等植物材料，用自来水、蒸馏水先后冲洗叶面，用滤纸吸干水分备用。叶片称重后剪成1cm长，置研钵中，经液氮冷冻后研磨成粉末。待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60～65℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，置于65℃水浴保温0.5~1h，不时地轻轻摇动混匀。 * CTAB法提取植物DNA的操作步骤 加等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。 将锥形瓶中的液体倒入离心管中，在室温下4 000r/min离心5min，静置，离心管中出现3层，小心地吸取含有核酸的上层清液于量筒中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。 * CTAB法提取植物DNA的操作步骤 根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。 收集上层清液，并将其倒入离心管中。慢慢加入1～2倍体积预冷的70%乙醇。可看到纤维状的沉淀（主要为DNA）。离心，即得到DNA粗制品。 * CTAB法提取植物DNA的操作步骤 6 上述DNA粗制品含有一定量的RNA和其它杂质。若要制取较纯的DNA，可将粗制品溶于TE缓冲液中，加入10mg/mL的RNase溶液，使其终浓度达50μg/mL，混合物于37℃水浴中保温30min除去RNA。 * CTAB法提取植物DNA的操作步骤 7 70％乙醇沉淀DNA。最后，将DNA溶于250μL 的TE缓冲液中。 * 　CTAB法流程图 植物材料 裂解液 上层溶液 液氮研磨 抽提 细胞裂解 干燥溶解 离心洗涤 酒精沉淀 DNA溶液 * 为了保证植物DNA的完整性，在吸取样品、抽提过程中应注意什么？ （1）整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）；这样可防止和抑制内源DNase对DNA的降解； （2）当DNA处于溶解状态时，要尽量减弱溶液的涡旋，动作要轻柔；在进行DNA溶液转移时用大口（或剪口）吸管，尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。 * 质粒DNA的提取 －碱裂解法 * 原理： 在碱性条件下线状DNA发生变性，质粒DNA维持环状。 在高盐条件下作复性处理，变性的染色体DNA会形成沉淀，从而将质粒DNA与染色体DNA分开。 * 质粒DNA的提取－碱裂解法 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合