兔抗Myosin X多克隆抗体的制备及初步应用.pdfVIP

第 44 卷第 1 期 东北师大学报(自然科学版) Vo l. 44 No.1 2012 年 3 月 Journal of Northeast Normal University(Natural Science Edition) March 2012 [文章编号]1000-1832(2012}Ol-0140-05 兔抗 Myosin X 多克隆抗体的制备及初步应用 张建华，施恒亮，翠艳华，俞华莉，曹让娟，朱彼娟 (东北师范大学生命科学学院，吉林长春 130024) [摘 要] 为制备兔抗肌球蛋白 X (myosinX , Myo X) 多克隆抗体，合成了含有 MyoX N 端 1 OOO~ 1 021 个氨基酸的多肤，将纯化后的多肤与钥孔戚血蓝蛋白 (keyhole limpet hemocyanin ,KLH)进行交联;通过背部皮下免疫新西兰大白兔获得免疫血清，并通过 ELISA、 免疫印迹、免疫荧光等分析对免疫血清进行了初步的验证.结果表明:经过 4 次免疫后可获得 免疫血清，ELISA 检测表明抗体终效价达到 1 : 51 200 ，抗原吸附实验进一步证明了此多克隆 抗体的特异性.利用获得的多克隆抗体检测了多种组织中 Myo X 的表达，发现兔抗 Myo X 多 克隆抗体可特异性识别多种组织中的 Myo X. 免疫荧光染色表明该抗体可以显示 Myo X 在 COS-7 细胞、NLT 细胞和神经元中的分布. [关键词] 肌球蛋白 X; 多克隆抗体;半抗原 [中固分类号] R 392. 1 [学科代码] 180. 2150 [文献标志码] A 肌球蛋白是一种马达蛋白，以肌动蛋白丝作为运行的轨道，通过 ATP 的水解导致构型的变化从而 在肌动蛋白丝上移动，调节细胞骨架的改构和细胞运动.目前鉴定的肌球蛋白家庭成员有 20 余种，其中 肌球蛋白 X Cmyosin X , Myo X) 是仅表达于脊椎动物中的一种肌球蛋白，相对分子质量为240 000. Myo X 含有与肌动蛋白及 ATP 结合的头部动力区;其颈部的 IQ 区域可与钙调蛋白结合，螺旋结构域 参与形成二聚体;其尾部区域包括了一个 PEST 蛋白水解位点， 3 个连续的 PH 结构域(pleckstrin homology domain) , MyTH4 结构域C myosin-tail homology 4 domain) 和 FERM 结构域(band-4. 1/ ezrin/ radixin/ moesin) [IJ • Myo X 的尾部结构域能与许多功能蛋白结合，目前已经报道的有 Netrin-1 受 体 DCC[2] 、 BMP 受体 ALK6[叫、Integrin[5-7] 及微管等.已有的实验证明:Myo X 定位在细胞的板状伪 足、膜榴皱和丝足顶端，通过与肌动蛋白的结合及 Mena/VASP 的运输参与丝足的形成与延伸过程[8] 一系列的酵母双杂交、体外相互作用和哺乳动物细胞实验证明，Myo X 通过 FERM 结构域与 DCC 及 Neogenin 的胞内段归结构域结合，从而在 Netrin-1-DCC 介导的神经轴突导向和突起生长过程中发挥 作用[9] 最近的研究表明，在动物大脑发育过程中还有另一种相对分子质量为165 000左右的无头形式 的 Myo X[10 lIU 同全长的 Myo X 相比，这种无头形式的 Myo X 缺少头部动力区，因此不具备分子马达 的功能[12] 但是这两种形式的 Myo X 是如何被转录调控的，目前尚不清楚. 半抗原又称不完全抗原，是指具有抗原性而无免疫原性的物质.半抗原能与相应抗体结合产生抗 原-抗体反应，但是半抗原本身相对分子质量过小，无法剌激机体产生免疫反应.用化学方法把半抗原与 具有免疫原性的大分子蛋白-载体相结合以后，半抗原就构成了载体的一个新的表位，这种半抗原-载体 复合物便能剌激免疫反应发生. Myo X 的相对分子质量比较大，抗原表位比较复杂，为了研究 Myo X 分子在肿瘤发生和神经发育 中的作用，本文利用 Plot of Protein Hydropathic Profile 软件对 Myo X 序列进行了分析，选取了 N 端 的 21 个氨基酸，以此多肤为免疫原制备了兔抗 Myo