不同冷冻保护剂和血清浓度对细胞冷冻效果的影响1.docxVIP

不同冷冻保护剂对细胞冷冻效果的影响 摘要：在基础实验小鼠胎儿成纤维细胞的原代、传代培养以及培养细胞的纯化的基础上，用含不同浓度(5%和10%)的几种冷冻保护剂（GL、DMSO和EG）和不同浓度血清（10%、20%和30%）的12种冷冻保护液冷冻细胞，通过测量解冻后细胞存活率，比较不同冷冻液的冷冻效果，并对此作初步分析，以期获得细胞冷冻的最佳方案。用台盼蓝对解冻复苏的细胞进行染色, 分析细胞活力,以细胞活率和24 h贴壁率评价冻存效果。结果表明: 冷冻剂10%EG+30%FCS因对细胞渗透性好、毒性小和血清浓度大，冷冻效果最好；冷冻剂5%DMSO和5%EG的冷冻效果也较好；而冷冻剂10%DMS+10%FCS的冷冻效果最差。 Abstract：Based on the basic experiments that the primary culture and subcultured of mouse fetal fibroblasts cells and purification of cultured cells, we used different cryoprotectants (GL, DMSO and EG)containing several different concentrations (5% and 10%) , and the type serum (10%, 20% and 30%), including 12 kinds of frozen protection fluid which froze cells. After thawing by measuring cell viability, compare the effect of different freezing frozen liquid, Through preliminary analysis, we try to look for the best cells frozen solution . Thawed cells were stained by trypan blue and analysis of cell viability to evaluate freezing effect. The results showed that: ryoprotectant 10% EG +30% FCS because of cell permeability, high toxicity and serum concentrations, freezing effect is the best; cryogen freezling effect of 5% DMSO+5% EG+30%FCS is also good; while refrigerant 10% DMSO +10% FCS’s freezing effect is the worst. 关键词:小鼠胎儿成纤维细胞、冷冻保护剂、冷冻、复苏 Keywords: mouse fetal fibroblasts；cryoprotectants，freezing；recovery 前言：在细胞培养实验中，细胞的冷冻复苏成为一种常规性的工作，是维持细胞系所必需的。由于冷冻液中冷冻保护剂的存在，在细胞冷冻过程中，细胞内水分在冻结前透出细胞外，在细胞外形成冰晶，可减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。但相同浓度的不同保护剂、不同浓度的同一种保护剂以及不同血清浓度对细胞冷冻效果也不尽相同。因此，本实验采用由不同浓度的甘油（GL）、二甲基亚砜（DMSO）和乙二醇（ＥＧ）以及不同浓度的血清组成的冷冻保护液对小鼠胎儿成纤维细胞进行冷冻和复苏，以期寻找最佳的冷冻保护剂和最佳浓度。 １ 材料与方法 １.１ 材料 １.１.１ 实验材料 小鼠胎儿成纤维细胞 １.１.２ 实验试剂 DMEM培养液；10％、20％以及30％胎牛血清（FCS）；5％和10％DMSO；5％和10％EG；10％GL；胰蛋白酶；0.1％台盼蓝溶液等。 １.２ 方法 １.２.１ 小鼠胎儿成纤维细胞的培养 无菌取小鼠胎儿，去除胎儿头、尾及内脏，只留下四肢及躯干部分，用消化培养法培养，经历原代及传代培养。 １.２.２ 细胞的冻存 去除培养液，加消化液2ml，消化3至5min；去消化液加洗涤液约2至3ml，洗涤一次；加洗涤液约5ml吹打，分散细胞，2500r/min，5min离心弃上清；加冷冻液约2.0ml，吹散细胞；装入冷冻管，用棉花包裹冷冻管，放入纱袋放入-70℃冰箱。 １.２.３ 细胞复苏 用长镊从液氮灌（或超低温冰箱）中取出细胞冻存管，立即投入盛有37