第三章 物理图谱.pptVIP

物理作图的主要方法 限制性作图（restriction mapping) 荧光原位杂交（fluorescent hybridization,FISH) 序列标签位点（STS )作图 （ sequence tagged sites mapping) 限制性作图的基本原理 比较一种DNA分子被不同限制性内切酶切割所产生的片段大小。 首先用一种酶处理样品后，电泳确定DNA片段的大小。 然后用第二种酶处理，获得第二组片段。 最后用两种酶混合处理，获得第三组片段。 收集上述资料进行对比组装。 两种酶切位点交替出现的区段用加减法确定其的相对位置。 连续出现2个或多个相同酶切位点的区段，采用部分酶解法。 切点过多时可以采用末端同位素标记结合部分酶解进行绘图。 限制性作图的规模受限于限制性片段的大小 限制性片段越大，切点越多，需要比较的片段也会增加，而且当片段多到一定程度，一些大小相似的片段会重叠在一起，不可能组成一个清晰的图谱。因此，限制性作图更适合于小分子。 实际应用中如果DNA分子小于50kb，通常可以选用识别6个核苷酸序列的限制酶来建立清晰的限制性图谱。 选用稀有切点限制酶的注意事项 识别顺序越长产生的片段越大，但当识别位点含非特异顺序时，片段长度小于预期； 识别位点的碱基组成影响限制性片段的大小。高等生物基因组一般A/T比较高, 应选G/C 高比例限制酶, 如-GC GGCCGC-(NotI) 限制酶识别位点较长，即使高等真核生物基因组也没有这种序列，可以通过转座或转导将这类酶切位点引入待测基因组； 基因组DNA甲基化对酶切位点出现频率的影响。高等生物基因组DNA甲基化比例很高, 但果蝇和酵母基因组无甲基化。 稀有切点限制酶在物理作图中的应用 低等生物基因组物理作图 大分子DNA克隆片段的物理作图 耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans) 基因组NheI酶切图 原位杂交的操作 染色体分裂细胞 染色体变性 检测信号 早期的原位杂交用的标记是放射性标记，但放射性标记很难同时满足灵敏度和分辨率两个原位杂交的必要条件。 20世纪80年代发展起来的荧光标记解决了这一矛盾。 为了得到高灵敏度，探针的标记量要尽可能大一些，以往的探针至少40kb。现在由于强信号荧光物质的发现和重标记技术的发明，对探针长度的要求已经不那么严格了。 如何提高荧光原位杂交的分辨率？ 原位杂交的分辨率与染色体的制备有关： 中期染色体分辨率1000kb，主要用于发现新的分子标记属于哪条染色体； 机械伸展的中期染色体分辨率200—300kb； 非中期染色体分辨率可达到25kb以下。 用特殊技术制备的纯化 DNA可以进行纤维-FISH，分辨率可达到10kb以下。 序列标记位点（Sequence tagged site, STS） :指一段短的DNA序列,通常长度在100-500bp,易于识别, 在待研究的染色体或基因组中仅存有1个拷贝。因此当2个片段含有同一STS顺序时，可以确认这两个片段彼此重叠。 序列标记位点作图：通过PCR或分子杂交将特定DNA顺序定位在基因组染色体区段中。 STS作图的原理 两个STS出现在同一片段的机会取决于他们在基因组中的距离，彼此靠的越近，分离的几率越小，彼此相隔越远，分离的几率越大。 两个STS之间相对距离的估算与连锁分析的原理一样，它们之间的图距根据它们的分离频率来算。 STS作图的DNA片段群 作图试剂（mapping reagent)：STS作图过程中用 到的可覆盖待研究的染色体或基因组的DNA片段群。 如何获得作图试剂？ 1）放射杂交 2）克隆文库 全基因组辐射杂种的筛选 使用不能产生胸腺激酶（TK)或者次黄嘌呤磷酸转移酶（HPRT)的仓鼠细胞系作受体。这种细胞在添加了次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基（HAT）中不能存活。只有获得人体DNA中TK和HPRT基因的仓鼠细胞才能在HAT选择性培养基中生长。 单染色体辐射杂种群 辐射杂种群用于作图试剂的条件 人类21号染色体辐射杂种图 一段人类染色体DNA的辐射杂种图 人类基因组辐射杂种图距 染色体 物理长度（Mb）cM/cR kb/cR 平均滯留率（范围） ———————————————————————————————— 1 263 0.20 197 21.1 (14.3-50.