7208年04医检细胞因子及其受体检测2008321.ppt

第二十五章细胞因子及其受体检测 学习要点： 生物学检测方法的种类、原理和技术要点 免疫学检测方法的种类 分子生物学检测方法的种类 比较三种细胞因子检测方法的优缺点 检测细胞因子受体的常用方法 细胞因子:是由活化的免疫细胞及某些基质细胞表达并分泌的活性物质，其主要生物学功能是介导和调节免疫应答及炎症反应，其化学本质是蛋白质或多肽。 细胞因子的种类 ---六大类（按功能分类）： 白细胞介素（interleukins，ILs） 干扰素(interferon，IFN) 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF） 集落刺激因子(colony- stimulating factor，CSF) 趋化因子（chemokines） 生长因子（growth factor，GF） 细胞因子检测方法 生物学检测法 免疫学检测法 临床上最常用 分子生物学检测法 第一节 生物学检测法 基本原理: 结果以活性单位(U/ml) 表示 指示细胞：短期培养细胞；依赖细胞株（系）； 依赖细胞株是指人们为检测某一种细胞因子而筛选的，该细胞株的分裂增殖只依赖于某一种细胞因子的存在，并在一定浓度范围内与细胞增殖程度呈正相关。若培养基中缺乏这种细胞因子，依赖株则不能存活。 IL-2指示细胞：CTLL（小鼠杀伤性T细胞系） 技术要点 依赖细胞株的准备 细胞因子作用于依赖细胞株 测定细胞增殖程度 细胞因子活性单位的计算 细胞因子的生物活性单位是指使相应细胞达到最大程度增殖的50％时所需细胞因子的含量为一个活性单位 。 待测样品50％最大程度增殖的稀释度 细胞因子活性（U/ml）＝ ×标准品的细胞因子活性单位 标准品50％最大程度增殖的稀释度 　　 IL-2依赖的CTLL用10％FCS-RPMI1640洗涤2次， 每次1000rpm, 5min, 除去原培养液中的IL-2 　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　 调整活细胞数1×10５／ml 　　　　　　　　　　　 ↓ 96孔平底培养板中每孔加入100μl不同稀释度标准IL-2和待测样品 　　　　　　　　　　　 ↓ 　　 每孔加100μl CTLL悬液　　　　　　　　　　　　 ↓ 　　　　　　37℃CO2孵箱，培养18～24h 　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　 每孔加３H-TdR 　　　　　　　　　　　　↓ 4-6h 　　　　　　用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上 　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　于液闪仪中测β射线的cpm值 技术要点 靶细胞的准备 TNF作用于靶细胞 细胞毒性反应程度测定 TNF活性计算 细胞毒反应程度测定： 检测死亡的细胞:51Cr释放法、台盼兰染色 检测剩余活细胞的数量间接判断 3H-TdR掺入法、MTT比色法、 结晶紫染色法:活细胞染色而死细胞不着色， 柠檬酸钠缓冲液脱色，测A570nm 取对数生长期的L929细胞，以0．01％胰蛋白酶消化用培养液调整细胞浓度至2×105／mL。 　　　　　　　　　　　↓ ??培养板中每孔加入100μL细胞悬液，置37℃，5％C02温箱孵育24h。 　　　　　　　　　　　↓ 每孔分别加入100μL稀释样品或标准品 　　　　　　　　　　　↓ 各孔加入10μL放线菌素D，37℃12—14h。 　　　　　　　　　　　↓ 离心弃上清，并用PBS洗细胞一次。 ↓ 每孔加入0．25％结晶紫 100／uL，室温下染色10min。 ↓ ?