6羟基多巴胺诱导SHSY5Y细胞帕金森病模型中1433蛋白表达的研究.docVIP

6羟基多巴胺诱导SHSY5Y细胞帕金森病模型中1433蛋白表达的研究 作者：王丹萍 常明 解洪荣 田明秀 胡林森 【摘要】 目的 应用蛋白质组学技术研究6羟基多巴胺(6OHDA)诱导SHSY5Y细胞帕金森病(PD)模型中1433蛋白的表达变化。方法 在建立6OHDA诱导SHSY5Y细胞PD模型的基础上，分别提取6OHDA实验组和对照组孵育24 h的细胞总蛋白，应用荧光差异双向凝胶电泳(DIGE)技术获得蛋白点的差异表达信息，运用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDITOF MS)鉴定出差异蛋白质。结果 DIGE分析发现实验组有一个表达明显上调的差异蛋白质点(P0.05)，经质谱分析鉴定确认为1433蛋白。结论 6OHDA诱导SHSY5Y细胞的PD模型中1433蛋白表达上调，提示1433蛋白上调可能与PD的发病机制有关。 【关键词】 6羟基多巴胺;SHSY5Y;帕金森病;1433蛋白;IDGE 帕金森病(PD)是一种常见的中老年神经系统变性疾病，其病理特征是中脑黑质致密部多巴胺(DA)能神经元进行性变性、坏死，但PD的发病机制现仍不完全清楚。神经毒素6羟基多巴胺(6OHDA)是DA神经递质的羟基化类似物和选择性DA神经元化学损毁剂，它选择性地作用于DA神经元，适用于研究DA能神经变性的详细机制及筛选新的 治疗 药物。SHSY5Y细胞系来源于人神经母细胞瘤株，其分化程度低、繁殖快，细胞形态、生理及生化功能与人正常神经细胞相似〔1〕。迄今为止尚无应用蛋白质组学技术对该模型进行系统研究的报告。本实验在建立6OHDA诱导SHSY5Y细胞PD模型的基础上应用荧光差异凝胶电泳(Differential Gel Electrophoresis，DIGE)技术研究6OHDA对SHSY5Y细胞毒性作用机制中的相关蛋白，为PD的发病机制及临床治疗提供理论依据。 　　 1 材料与方法 　　1.1 细胞、试剂及仪器 SHSY5Y细胞来自American Type Culture Collection(ATCC)。6OHDA、DMSO、胰蛋白酶购自Sigma公司。高糖DMEM培养基购自Gibco公司;新生胎牛血清购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司;Cleanup试剂盒、2D Quant试剂盒、固相24 cm IPG胶条(pH4～7)、CyDye荧光染料(Cy2，Cy3，Cy5)以及其他双向电泳和质谱分析试剂，Ettan IPGphor 等电聚焦仪、DALT Six垂直电泳系统、切胶仪、酶切仪、点靶仪和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDITOF MS)均购自Amersham BiosciencesGE Healthcare公司。荧光倒置显微镜为Olympus公司产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 用含5%的新生胎牛血清、100 μg/ml青霉素/链霉素的高糖DMEM培养基培养细胞，置于37、5% CO2培养箱中，隔天换液。待细胞进入对数生长期后，用0.25%的胰蛋白酶消化后，以2×105/ml密度接种于底面积25 cm2的培养瓶(15 ml/瓶)。孵育24 h后，实验组和对照组分别加入6OHDA(终浓度为6OHDA 100 μmol/L，VitC 0.002%)和0.2% VitC溶液(终浓度为0.002%)，继续孵育24 h。取4批不同代数的细胞进行培养。 　　1.2.2 蛋白提取 收取细胞，加入细胞裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS，30 mmol/L Tris)，经室温作用1 h后离心取上清。蛋白样品经cleanup试剂盒去除杂质后，再用2D Quant试剂盒测定浓度。 　　1.2.3 DIGE 将各样品pH值调至8.5，进行分组并制备内标，再以400 pmol CyDye：50 μg蛋白的比例标记各样品及内标，避光冰浴30 min后，用1 μl 10 mmol/L赖氨酸终止反应。分析胶：内标蛋白、对照组及实验组蛋白分别进行荧光(Cy2、Cy3、Cy5)标记。按标准实验规程进行水化及聚焦电泳：采用线性IPG胶条(pH4～7)，定量蛋白上样，水化和电泳，并灌制24 cm×20 cm PAGE胶，进行IPG胶条平衡及转移，24 cm电泳仪垂直电泳。制备胶：取对照组及实验组蛋白样品各800 μg，酸性端放置蛋白分子量标志，按分析胶方法进行双向电泳。考马斯亮蓝染色。 　　1.2.4 图像分析及统计学处理 使用Typhoon 9400扫描仪对分析胶进行图像扫描，并且以De CyderTM分析软件进行蛋白变化比对，其中AV比值1.5，配对t检验P0.05为有显著差异的蛋白点。切取与差异蛋白相匹配的制备胶蛋白点，经酶切(20 μg/L胰酶，37，2 h)、点靶后