实验五：小鼠骨髓染色体的制备与C带染色.pptVIP

实验八：小鼠骨髓染色体的制备与C带染色 一.小鼠骨髓染色体的制备 学会小鼠骨髓染色体标本的制备 【实验原理】 处于分裂期的细胞经秋水仙素处理,由于阻断了纺锤丝微管的组装,使细胞分裂停止于中期,此时染色体达到最大收缩,具有典型的形态。 本实验所用的小鼠骨髓细胞具有高度的分裂活性并且数量非常多,经秋水仙素处理后,可使分裂的细胞阻断在有丝分裂中期,再经低渗、固定、滴片染色等处理,便可制作较好的小鼠骨髓细胞染色体标本。 【仪器、材料和试剂】 （一）仪器显微镜,温箱,冰箱,离心机,天平。 （二）材料 解剖器皿(解剖盘,剪刀,镊子),注射器(1mL),4号针头,6号针头,纱布,脱脂棉,酒精灯,试管,试管架,滴管,50mL烧杯,染色缸,洗耳球,量筒,载玻片(实验前将载玻片浸入50％的酒精溶液中,置4℃冰箱中至少1h)。 （三）试剂 0.85％生理盐水,冰醋酸,甲醇,Ph6。8PBS,Giemsa染液,75％酒精,蒸馏水,秋水仙素(1mg/mL),0。075mol/lKCl。  1．秋水仙素:以1mg/mL的浓度溶于0.85％生理盐水中。 2．低渗液: 0.075mol/lKCl取5.59gKCl加到1000mL蒸馏水中,在37℃下预热。 3．固定液:甲醇:冰醋酸以3:1配制(新鲜的) 【实验步骤】 1.取雌雄小鼠各一只,注射秋水仙素0。1mL于腹腔中,经3。5- 4h后拉颈椎处死。 2.剪开腹腔,剥离出两条后肢,由股骨关节处剪断,取下后肢(注 意不要将股骨剪断)。 3.将骨骼外面的肌肉尽可能剪掉,剩下附着在骨骼上的少许肌 肉,用棉花或 纱布蘸75％酒精来回搓,直到骨骼外面不带任何肌肉为止。 4.剥离股骨,并将股骨头的两端减去少许,然后用4号针头插入 骨髓腔内,将股骨穿通(注意:不要用力过大,以防骨骼破裂)。 5.将带6号针头的1mL注射器插入骨髓腔1/2部位,然后将股骨 浸入含0.85％生理盐水的离心管内,操纵注射器将骨髓细 胞全部冲洗到离心管内,直至骨髓腔呈白色为止。然后丢弃 股骨,换4号针头轻轻抽打离心管内的细胞,尽可能使其分散。 6.将细胞悬液1000r/min离心8-10min,弃去上清液。 7.低渗处理:向细胞中加入5mL在37℃预热的0.075mol/lKCl溶 液,用吸管轻轻抽打均匀,置37℃水浴低渗处理15min. 8.在低渗处理期间,配置固定液,即3:1的甲醇:冰醋酸,放 在密闭的 瓶中,置4℃冰箱中备用。 9.预固定:低渗处理后,立即加入1mL新配制且预冷的固 定液,抽打均匀,然后1000r/min离心8min,弃去上清液。 10.固定:沿离心管壁慢慢加入新配制的固定液5mL,用 吸管轻轻抽打均匀,室温下固定30min。 1000r/min离 心8min,弃去上清液。 11.再固定:再次加入固定液5mL,抽打均匀后,置于4℃冰箱 中固定30min或更长时间,必要时也可过夜。 1000r/min 离心8min,弃去上清液。 12.根据管底细胞的多少,加入新配制的固定液0.3-0.5mL, 用吸管轻轻抽打均匀,形成细胞悬液。 13.制片:将预冷的载玻片倾斜45度角, 用吸管取细胞悬液, 从约1.5m高处,向每张载玻片上滴1-2滴,立即用口吹散, 然后用镊子夹住载玻片的一端,立即放酒精灯火焰上过几遍。 14.染色:将载玻片平放在染缸内,自然干燥或用吹风机吹干, 以Giemsa染液染色,根据染色效果,染色6-10min后,用蒸馏 水轻轻冲洗,并晾干。 15.镜检:先用低倍物镜找出分散好的分裂相视野,再换高倍 镜和油镜观察,细胞质被染成蓝色,细胞核被染成淡紫色。 【注意事项】 1.注意小鼠雌和雄的分辨:雌小鼠的生殖孔距离尿道口较近;雄小鼠的生殖孔距离尿道口较远。 2.骨髓细胞滴片时高度的掌握很重要,可在1-1.5m间进行预实验。 3.骨髓细胞滴片在酒精灯火焰上应多过几次,使胞膜和核膜充分涨裂,才能释放出染色体。 4.如果只做小鼠骨髓染色体制备,可省略11再固定;如果继续做C带染色,必须再固定。 5.Giemsa染色后,切勿先将染液倾去再冲洗,应在染液倾去前直接轻轻冲洗玻片,以免染液中细小颗粒附着于标本,影响观察。 【实验报告】 1.找出你制备最好的几个分裂相视野,数出染色体条数。 2.画出你所看到的一个中期分裂相的图像。 3.总结制备成功或失败的经验。 【思考题】 1.小鼠染色体形态上有什么特点?共有多少条? 2.微管特异性药物秋水仙素在本实验中的作用是什么? 3.简述有丝分裂4个时期的主要特点。 二.染色体C带的制备 【实验原理】 借助特殊的燃料及染色程序,使染色体的一定部位呈现深浅不同的带纹,可用来鉴别染色体组,单个染色体以及深入认识染色体的结构和功能。 C带可使着丝粒区,端粒区的异染色质及其