聚乙烯亚胺介导的E1A基因对肝癌细胞的化疗增敏效应.docVIP

聚乙烯亚胺介导的E1A基因对肝癌细胞的化疗增敏效应 作者：孙海丰，刘东方，刘永彪 【摘要】 目的 以自行合成的聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEi)纳米凝胶为载体转染E1A基因，并观察E1A基因对肝癌细胞体外生长的抑制作用及其对化疗药物的增敏效应，初步探讨其作用机制。方法 经PEI介导，将真核细胞高效表达E1A基因的重组质粒psv-E1A导入人肝癌H22细胞，RT-PCR证实其转染，G418筛选出阳性克隆细胞，观察EIA基因对该细胞系生长的抑制作用。用MTT法测定转染E1A基因前后，顺铂、泰素、5-氟尿嘧啶、博来霉素对肝癌H22细胞的效应。结果 质粒psv-E1A测序结果与基因库E1A基因序列完全相符。G418筛选出阳性克隆细胞。RT-PCR结果显示PEI能转染质粒psv-E1A并有稳定的表达。转染E1A基因后，H22-E1A细胞对顺铂、博来霉索、泰素的敏感性显著提高（P0.01），而对5-氟尿嘧啶的敏感性无明显变化（P0.05）。结论 PEI能正常转染质粒psv-E1A, E1A基因能够明显抑制肝癌H22细胞的生长，并明显提高其对顺铂、博来霉索及泰素等化疗药物和放射线的敏感性。其机制可能与E1A基因改变肿瘤细胞的增殖状态和细胞周期时相有关。 【关键词】 E1A基因；基因转染；肝癌细胞；聚乙烯亚胺；四甲基偶氨唑盐微量染色法 基因 治疗 的载体主要分为病毒载体系统和非病毒载体系统。由于病毒载体有免疫原性高、毒性大、目的基因容量小、靶向特异性差、制备较复杂及费用较高等缺点，人们愈来愈重视非病毒载体的研究。非病毒载体较安全，免疫原性低,而且是基于质粒的转染，易于组装。聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)是近年来研究最为广泛的阳离子多聚物非病毒基因载体之一，1995年，Boussif等［1］首先报道了PEI可作为非病毒载体。其后, PEI成为非病毒载体研究 发展 最快的领域，其中线型和支链状的PEI是研究最活跃、基因转导效率最高的阳离子聚合物之一。 基因治疗的另一个关键是目的基因， E1A基因可以作用于肿瘤细胞的多个癌基因和抑癌基因，如调控p53、HER-2/neu、RB和nm23等癌基因和抑癌基因；并且E1A基因的作用不依赖肿瘤细胞的基因状态，这使得E1A基因治疗较其他针对单一癌基因或抑癌基因的基因治疗(如p53基因)具有更好的应用价值和前景。 本研究以PEI为载体，将真核细胞高效表达E1A基因的重组质粒psv-E1A导入人肝癌细胞系H22，RT-PCR证实其转染，用MTT法测定转染E1A基因前后，顺铂、泰素、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、博来霉素对肿瘤细胞敏感性的作用,对阐明高分子树枝状纳米载体在肿瘤靶向治疗中的安全、有效转导机制有重要意义和较大的应用价值。 　 　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 PEI纳米凝胶 　　本课题利用掌握粒径精确可控纳米凝胶光化合合成方法，以水溶液光化学法合成具有各种粒径的PEI纳米凝胶［2-3］。具体参数见表1。表1 PEI的参数（略） 　　1.1.2 psv-E1A质粒 　　由上海东方肝胆 医院 苏长青教授惠赠,在DH5-α菌株中扩增，用DNA质粒纯化试剂盒(QIAGEN公司) 制备质粒。质粒D260/D280比值在1.6～1.9 之间,过滤除菌，－20保存。 　　1.1.3 转染细胞 　　H22肝癌细胞购自南京凯基生物科技发展有限公司，生长在含10 %小牛血清（FCS）的RPMI 1640培养基中。 　　1.2 方法 　　1.2.1 实验步骤 　　本实验应用PEI转染质粒psv-E1A入肝癌细胞，G418筛选其阳性克隆细胞，RT-PCR证实，分别加顺铂、博来霉素、泰素、5-Fu入阳性克隆细胞及未转染的细胞，24 h后MTT法测量生存率,观察E1A基因对多种作用机制不相同的化疗药物有无增敏作用。 　　1.2.2 基因设计与测序 　　从基因库内查E1A基因序列,并设计引物。上游引物：5′-cggaggtgttattaccgaag-3′；下游引物: 5′-tcgtcactgggtggaaagcc-3′。E1A基因测序结果与从基因库内下载的E1A基因序列完全一致。 　　1.2.3 基因转染 　　转染复合物的N/P比值对转染效率的影响很大。N/P比值指的是转染复合物中PEI分子所含的N原子与DNA分子中所含的P原子的摩尔比 。1 μg 的DNA 分子中含有3 nmol 的P原子。按照不同的N/P比值调整PEI 溶液(4.3 mg/ml) 的使用量(表2) 。表2 不同N/P比值的PEI 溶液的使用量（略） 　　1.2.4 PCR反应 　　按表3制备50 μl PCR反应：离心数秒，上PCR仪扩增，琼脂糖凝胶电泳观察结果。 表3 PCR反应组