桦褐孔菌纤维素酶基因的克隆与原核表达.pdfVIP

食用菌学报@2016．23(4)：14～19 DOI：10．16488／j．cnki．1005—9873．2016．04．003 桦褐孑L菌纤维素酶基因的克隆与原核表达 安丹丹，张宇婷，李健，陈艳秋+ (延边大学农学院园艺系，吉林省延吉市133002) 摘要：成功获得了桦褐孔菌(1nonotus 01菌株的内切葡聚糖酶(IO—EG)和B．葡萄糖苷酶(IO— obliquus)JL BGL)的cDNA全长序列。e92基因cDNA序列全长(ORF)为1149bp，编码382个氨基酸，坛f2基因cDNA 序列全长(ORF)为2583 后，SDS．PAGE电泳分析表明两个菌株均表达蛋白，且蛋白以包涵体形式存在，为桦褐孔菌高效外源基因表达 系统的建立提供了基础。 关键词：纤维素酶基因；桦褐孑L菌；原核表达 纤维素酶是能够将纤维素降解成葡萄糖的一组酶的总称，它是一类复杂水解酶的复合物，称为纤 维素酶系，根据催化功能可分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和G一葡萄糖苷酶三种。食药用真菌中有 纤维素酶的活性密切相关；赵丽[23等研究桦褐孑L菌代料栽培期间胞外酶变化规律时发现，在菌核形成 及成熟阶段纤维素酶活性较高。 草菇发育的不同阶段均有表达，而内切葡聚糖酶的转录水平只在子实体发育过程中逐渐增加。隋飞飞 等[53通过对桦褐孔菌内切葡聚糖酶基因的克隆与定量表达分析，发现随着菌核的生长发育，EG的表达 解13．葡萄糖苷和|3．半乳糖苷，有些酶还能水解木糖苷、果糖苷等多种糖苷，此外它还具有直接糖基化和 转糖苷活性，在低聚寡糖和糖苷合成中具有重要作用[6]。目前已有成百上千个BGL基因得到克隆，然 在草菇不同发育过程中均有表达，并且其表达量与子实体大小成正比。隋飞飞等[83克隆了桦褐孑L菌 BGL基因，并发现在菌核发育过程中，其表达量呈先上升后下降趋势。 桦褐孔菌[Inonotus 2I。然 用真菌，16世纪以来，被广范应用于治疗胃肠道癌症、心血管疾病和糖尿病，没有任何毒副作用[1 而，桦褐孔菌的野生资源非常有限，仅在俄罗斯，芬兰，波兰，中国的少数地区分布[2]，而且人工栽培的 菌核产量较低，因此桦褐孔菌规模化人工栽培的研究迫在眉睫。纤维素酶在桦褐孔菌生长发育过程中 具有重要作用，因此研究纤维素酶在菌核中的分泌表达具有重要意义。笔者以桦褐孔菌JL01人工栽 培菌核为试材，成功克隆出内切葡聚糖酶和B．葡萄糖苷酶基因全长，并成功获得大肠杆菌原核表达菌 株，进行诱导表达，为进一步探索纤维素酶在桦褐孔菌菌核发育期所发挥的具体功能提供基础。 收稿日期：2016—08—08原稿；2016—09—01修改稿 基金项目：国家自然科学基金项目31460536)资助 作者简介：安丹丹(1990一)，女，在读硕士，主要研究方向为生物技术在食药用真菌中的应用。 。本文通讯作者E-mail：cyq326@126．com 万方数据 第4期 安丹丹，等：桦褐孔菌纤维素酶基因的克隆与原核表达 1材料与方法 1．1材料 1．1．1供试菌株 供试桦褐孔菌(Inonotus DH5a(E．coli 验室保存；大肠杆菌菌株Trans 限公司。 1．1．2栽体与试剂 供试T／A克隆载体pMD．18Tsimple H。)、RNase 学预防兽医实验室馈赠；Trizol试剂、反转录酶M．MLV(RNase LA HI，勋f工T4DNA连接酶、DNAMarker、蛋白Marker、 Taq酶、限制性内切酶EcD尺工，劢D工，Bam 胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自大连宝生物有限公司。 1．2方法 1．2．1引物设计与合成 长(登陆号分别为：KP970547和KP970549)，利用Primer5软件，在参考序列开放阅读框的上下游分 别设计一对引物，并在IO．曙上下游引物5’端分别插入EcoR工，劢DI限