实验四.重组质粒载体的构建.pdfVIP

生物技术大实验—实验四 重组质粒载体的构建 • 限制性酶切概述 • DNA片段的回收 • 重组质粒的构建 • 实验仪器设备 • 实验试剂 • 实验步骤 • 注意事项 一、限制性酶切概述 限制性内切酶能特异地结合于一段 被称为限制性酶识别序列的DNA序列之 内或其附近的特异位点上,并切割双链 DNA 。 它可分为三类: Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一 蛋白质分子中兼有切割和修饰( 甲基化)作 用且依赖于ATP 的存在。Ⅰ类酶结合于 识别位点并随机的切割识别位点不远处 的DNA ，而Ⅲ类酶在识别位点上切割 DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两 种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限 制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另 一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别 序列。 Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中 得到了广泛应用，它们是重组DNA 的基础。 绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核 苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如 EcoR Ⅰ识别六个核苷酸序列:5- G ↓AATTC-3),有少数酶识别更长的序列 或简并序列。 Ⅱ类酶切割位点在识别序列中, 有的在对称轴处切割,产生平末端的 DNA片段(如Sma Ⅰ:5-CCC ↓GGG- 3);有的切割位点在对称轴一侧,产生 带有单链突出末端的DNA片段称粘 性未端, 如EcoR Ⅰ切割识别序列后 产生两个互补的粘性末端。 5…G ↓AATTC…3 →5… G AATTC…3 3…CTTAA ↑G …5 →3… CTTAA G…5 DNA纯度、缓冲液、温度条件及限 制性内切酶本身都会影响限制性内切酶 的活性。大部分限制性内切酶不受RNA 或单链DNA 的影响。当微量的污染物进 入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进 一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每 次都要用新的吸管头。如果采用两种限 制性内切酶,必须要注意分别提供各自的 最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则 可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低 盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随 后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内 切酶水解。 也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿 抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙 醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥 并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 　　DNA 限制性内切酶酶切图谱又称DNA 的物理 图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶 切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序 列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA 的无性繁 殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶 图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的 RFLP( 限制性片段长度多态性)技术更是建立在它 的基础上。 构建DNA 限制性内切酶图谱有许多 方法。通常结合使用多种限制性内切酶， 通过综合分析多种酶单切及不同组合的 多种酶同时切所得到的限制性片段大小 来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。 酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性 和精确程度。 　　 在酶切图谱制作过程中，为了获得 条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量 约为0.5-1 μg 。限制性内切酶的酶解反 应最适条件各不相同,各种酶有其相应 的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数 为37℃) 。对质粒DNA酶切反应而言, 限 制性内切酶用量可按标准体系1 μg DNA加1单位酶,消化1-2小时。但要完 全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2- 3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。 二、DNA片段回收 质粒、噬菌体等经酶切、电泳； PCR产物经电泳后，常常需要对一 些DNA 电泳片段进行回收和纯化， 用于亚克隆、探针标记等。DNA 回 收和纯化常用方法有压碎法、低融 点琼脂糖法、冻融法等，也有现成 的试剂盒供应。 三、重组质粒的构建 将经过酶切、回收纯化后的 PCR产物与质粒载体用T4DNA连 接酶连接的过程称为重组质粒载 体的构建。 四、实验仪器设备 水平式电泳装置, 电泳仪,台式高速 离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 照相支 架, 照相机及其附件。