原核细胞中蛋白质的表达.pptVIP

QIAGEN PCR Cloning System Protein expression checklist Promoter Source of RNA polymerase Ribosome binding site Readsing frame Drug selection Storage of construct Medium Induction condition Detection method Storage of protein IMPACTTM-TWINS pTWINS IMPACTTM-TYB11 pTYB11 * Expression of Protein in Prokaryotic Cell 北京大学医学部 基础医学院 细胞生物学系 甄红英 Expression of the fluorescent GFP-CBP fusion protein in bacterial (Panel A) and mammalian cells (Panel B) is shown The Western blot in Panel C Lane 1: CHO cell lysates. Lane 2: Bacterial cell lysates. Lane 3: Commercially available recombinant GFP for size comparison.  制备pET 载体 制备插入DNA 将插入的DNA片断克隆到pET 载体 转化表达质粒到宿主菌 诱导/优化表达目的蛋白 放大实验 纯化目的蛋白 主 要 过 程 Procedure of Recombinant Protein in Vitro Target gene Choice of vector Ligation Transformation Screen and identify positive clones Sequence Expression and purification target protein Source of target gene Genomic DNA cDNA Chemical synthesis PCR amplification Source of target gene 表达载体的选择 蛋白质 基因 可分泌性 融合蛋白的加工 启动子 融合蛋白 天然蛋白 原核基因 真核基因 pET载体系统 目的基因被克隆到pET质粒载体 受噬菌体T7强转录及翻译（可选择）信号控制 表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导 两种启动目的蛋白表达的方式 带有受λ pL和pI启动子控制的T7RNA聚合酶的λ CE6噬菌体侵染宿主细胞 将质粒转入带有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因的表达型细胞 选择合适的pET载体 转录载体 表达本身带有原核核糖体结合位点和AUG起 始密码子的目的基因 3种：pET-21(+)、 pET-24(+)和 pET-23(+) 翻译载体 来自T7噬菌体主要衣壳蛋白的高效核糖体结合位点 用于表达那些不带有核糖体结合位点的目的基因 选择合适的pET载体 翻译载体在命名上与转录载体不同，多一个字母后缀 pET-21a(+) 表示相对于BamHI克隆位点识别序列GGATCC的阅 读框，所有带后缀a的载体从GGA三联密码子开始表达； pET-21b 带b的从GAT开始； pET-21c 带c的从BamHI识别序列ATC三联密码子开始； pET-21d 带d后缀的载体阅读框和带c的一样，不同的是它们有 一个上游Nco I克隆位点而非Nde I位点以便直接将目的基 因克隆到AUG起始密码子 选择合适的pET载体 基本考虑因素 1. 目的蛋白的应用 2. 目的蛋白已知特定信息 3. 克隆策略 细胞溶解性及细胞定位 载体可以通过