基因工程第6章DNA重组的操作22.pptVIP

Review 2.1 重组质粒DNA转化大肠杆菌 转化（transformation） 定义 转化微生物的种类 感受态细胞 P139 转化过程 1.定义 转化：受体菌直接吸收供体菌的DNA片断而获得后者部分遗传性状的现象。 转化子（transformant）：通过转化方式而形成的杂种后代。 2.转化微生物的种类 首次发现转化现象 肺炎链球菌（Griffith,1928） 嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、奈瑟氏球菌属、根瘤菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属等。 3. 感受态（competence） 感受态：指受体细胞最易接受外源DNA片断并能实现转化的一种生理状态。 感受态是细菌的一种遗传特性，而且也受生长阶段、培养条件的影响。 肺炎链球菌 对数生长后期 芽孢杆菌属 指数期末和稳定期 大肠杆菌 刚进入对数期 感受态细胞的制备 1、挑取平板上的大肠杆菌单菌落接种于2 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜 2、按1％的接种量接种于3 mL新鲜LB培养液，37℃剧烈振荡培养至OD600为0.4-0.6(可见雾状) 3、倒至1.5mL的eppendorf管中,4℃下12,000 rpm离心1 min，倒出培养液，用无菌滤纸尽量吸干 4、加入1mL 预冷的无菌0.1mol·L-1 CaCl2溶液涡旋，4℃下12,000 rpm离心30秒,尽量去除上清 5、沉淀以50-100μL 预冷的0.1mol·L-1 CaCl2重悬，4℃保存备用，7d内可用。 6.3 重组子的筛选与鉴定（P152） 重组子的筛选（选择）： 经过各种方法将外源DNA分子导入受体， 获得所需目的重组子的过程 转化子：导入外源DNA分子后稳定存在的受体细胞。 重组子：含有重组DNA分子的转化子。 重组子常见的筛选方法 P152 抗药性筛选法 利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行筛选 插入失活筛选法 显色互补筛选法 IPTG＋X-Gal α-肽 营养缺陷型检测法 根据目的基因在受体细胞中表达产物的性质，筛选阳性克隆。 载体分子携带有某种营养组分的基因，而宿主细胞不能合成此营养组分，因此将转化细胞涂布在此营养缺陷型培养基上，能够生长的就是转化子 2、PCR法鉴定 提取质粒 利用特异性引物，扩增目的序列 电泳，观察结果 质粒的提取 小量提取（碱裂解法，NaOH/SDS） 0.7%~0.8%琼脂糖凝胶电泳（检测所提取的质粒的纯度和完整性） 凝胶成像系统观察电泳结果 质粒的提取（碱裂解法，NaOH/SDS） 取1.5mL培养的克隆菌，12,000rpm离心1 min，加入预冷的100μL GET悬浮沉淀，涡漩，室温静置5 min； 加入200μL新鲜配制的NaOH/SDS碱裂解液，上下颠倒温和混匀，置冰上5 min； 加入150μL乙酸钾溶液中和，上下充分混匀，迅速置冰上5 min； 12,000 rpm离心5 min，吸取400μL上清液移入干净的离心管中； 加800μL 95％（100％）乙醇，室温放置3 min； 12,000 rpm离心5 min，用1mL 70％乙醇洗涤沉淀2次，真空干燥约5 min； 沉淀用10-15mL TE（含10mg·L-1 RNase）溶解。-20℃保存备用。 《分子克隆实验指南》（第三版），科学出版社，2002。 PCR鉴定 提取质粒，以之作为模板进行PCR，扩增目的序列 0.6~1%琼脂糖凝胶电泳 凝胶成像系统观察电泳结果 3、酶切鉴定 提取的质粒为模板，双酶切，37℃水浴0.5~1h 1%琼脂糖凝胶电泳 凝胶成像系统观察电泳结果 双酶切鉴定 4、杂交法鉴定 Southern blot：DNA水平 Northern blot：RNA水平 Western blot：蛋白质水平 5、测序 专业的公司进行测序 拼接（将测序结果拼接出完整的序列） 比对(alignment)，确定目的基因正确与否 一些序列分析软件，eg. DNA star，DNAMAN，DNAClub等 序列比对 / BLAST(Basic Local Alignments Search Tool) 最为常用的序列相似性比较的工具。 用于确定未知序列与数据库序列的最佳局部比对 根据序列和数据库中的序列不同类型分为5种 相似性比对结果分析 Bit分值：分值越高，比对越好 E值：序列比对的统计学显著性指标。E值越低，则比对就更有可能具有显著性。统计学上显著性并不一定表示生物学上的相关性。 从比对的结果，可以推测目的序列是否正确。 若序列已知，则只要利用软件将所测的序列拼接，并与已知序列比较，看是否完全相同 作业 4 1、什么是感受态细胞？大肠杆菌感受态细胞如何制备？ 2、简述常见的筛选重组子方法？ M