基因工程-第二章基因工程的工具酶.pptVIP

内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。 完全消化（Complete Digestion） 1 2 3 4 1 2 3 4 只有有限数量的酶切位点被切开。 通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。 局部消化 1 2 3 4 1 4 部分酶切（Part Digestion） 第二节 DNA连接酶（ DNA Ligase ） 1967年，世界上数个实验室几乎同时发现该酶。 2.1 基本性质： 能将两段DNA拼接起来的酶，催化DNA相邻的5‘磷酸基团和3’羟基末断之间形成磷酸二酯键，封闭DNA单链缺口。 2.2 T4 DNA连接酶的作用机制： ① ATP+DNA ligase(E)→ E-AMP+PPi。 ② E-AMP上的AMP转移到DNA的5’磷酸根上， 使其活化，释放出酶。 ③ 活化的5’磷酸根与相邻的3’羟基形成3’,5’-磷酸二酯键，并释放出AMP。 8.1.3 两种DNA 连接酶 比较 T4 DNA ligase E .coli DNA ligase 来源 T4 噬菌体 大肠杆菌 分子量 68 kD 75 kD 辅助因子 ATP NAD+ 底物 1) 双链DNA分子的粘、平端 1)同源互补粘端 2) RNA-DNA杂合体、RNA链缺口 2)双链分子中的单链缺口 3) 双链DNA分子中的单链缺口 应用范围 广泛 . 效率高 窄 修复双链DNA缺口处的磷酸二酯键 修复与RNA结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键 连接多个平头双链DNA分子： 注意：DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的必须是双螺旋DNA分子的一部分。 2.3 DNA片段之间的连接 2.3.1 具互补黏性末端片段之间的连接 基本原理：用DNA连接酶连接具有互补粘性末端DNA片段。 2.4 具平末端DNA片段之间的连接 基本原理：直接用T4DNA连接酶连接. 2.5 DNA片段末端修饰后进行连接 1) DNA末端同聚物加尾后进行连接 基本原理：利用末端脱氧核苷酸转移酶转移核苷酸的特殊功能在DNA的末端加尾。 2) 黏性末端修饰成互补粘端或平末端后进行连接 基本原理： 采用两种方法 ①修平：用核酸酶切除双链DNA分子的突出核苷酸，修平后用T4连接酶作平末端连接。 ②补平：用Klenow酶将粘端补平，产生平末端或匹配粘端，再用T4连接酶进行连接。 HindIII↓ ↓XbaI 5’----A CTAGA----3’ 3’----TTCGA T----5’ dATP dTTP Klenow dGTP dCTP Klenow 5’----AAG CTAGA----3’ 3’----TTCGA TCT----5’ T4 DNA ligase 5’----AAGCTAGA----3’ 3’----TTCGATCT----5’