基因工程课件E—基因转移与重组体筛选.pptVIP

第七章 基因转移与重组体的检测 　　第一节 重组体DNA向宿主细胞的导入 一. 导入方法 转化：以质粒为载体将重组体DNA导入寄主细胞。 转染：以未包装的噬菌体为载体将重组体DNA导入受体寄主细胞。 转导：以包装的噬菌体为载体将重组体DNA导入寄主细胞。 感染：以动植物病毒为载体将重组体DNA导入宿主细胞。 二. 感受态细胞制备 感受态细胞：受体宿主细胞经处理后变成易于接受重组体DNA分子的状态。 　　感受态细胞的制备：最常用的方法是氯化钙处理法。 氯化钙法的原理：氯化钙具有提高细胞膜通透性的作用，从而使细胞变为感受态。 . 提高转化效率的方法 普通转化实验，pBR322的转化效率：106转化子/μgDNA。 使用大肠杆菌X1766作受体菌，转化效率可提高到108。 使用碱性磷酸酶处理, 脱去载体切口的5′磷酸基，阻止没有插入外源DNA分子的载体自身环化。 三.噬菌体转导法转移重组体DNA 用噬菌体作载体转移外源基因一般都要对重组的噬菌体进行包装后才用于感染受体细胞，可以提高感染效率2个数量级，达到106。才能满足构建基因文库的需要。 λ噬菌体的体外包装 体外包装是指在试管中完成噬菌体在寄主细胞内的全部包装过程。 体外包装原理：噬菌体在寄主细胞内的包装，头部和尾部是分开进行的，如果包装头部的蛋白基因发生了突变，则只能形成尾部蛋白；如果包装尾部的蛋白基因发生了突变，则只能形成头部蛋白质。操作中是将头部和尾部发生突变的两种不同突变型噬菌体的提取物混合，与重组的的λDNA一起温育，就能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。 　　　用体外包装的重组噬菌体颗粒感染受体细菌细胞，感染效率可提高100～10000倍。 已经构建了2株缺陷型噬菌体： （1）头部E基因发生了琥珀突变的噬菌体（E—），由于E基因突变，噬菌体不能合成E蛋白，不能形成任何头部结构，所以在它所感染的寄主菌中积累了大量的尾部外壳蛋白； （2）头部外侧D基因发生了琥珀突变的噬菌体（D—），由于噬菌体不能合成D蛋白，λ的DNA不能进入头部，从而积累了大量的头部蛋白． 将2种突变噬菌体所感染的受体菌细胞进行提取，将提取物再混合，由于2种突变噬菌体感染细胞的提取物在体外是互补的，便可以在体外对重组的λ噬菌体进行体外包装。 噬菌体包装蛋白制备和包装方法 头部E基因琥珀突变的噬菌体 　　　　 头部D基因琥珀突变的噬菌体 　尾部不能被包装 头部不包装 积累了大量的尾部蛋白 积累了大量的头部蛋白  　　　　　　　　　提取物混合 　　　　　　　　　↓ 与重组噬菌体一同温育 琥珀突变：遗传密码变为终止子UAG。 赭石突变：遗传密码变为终止子UAA。 无义突变 乳白突变：遗传密码变为终止子UGA。 体外包装限制 　　噬菌体头部外壳蛋白的包装能力为正常野生型噬菌体DNA总量的75～105%，超过或低于上述范围，外壳蛋白就不能有效包装。这一特性保证了当用替换法插进外源DNA时，如果外源DNA没有插进载体，由于达不到75%要求标准，噬菌体就不能被包装。成功感染的噬菌体基本都是插入有外源DNA的重组型或噬菌体自身重新连接形成的原形体，2种类型具有表型区分特征，重组型为透明噬菌斑，自身连接载体为浑浊噬菌斑。 细胞转化的程序： （1）感受态细胞制备和复苏; （2）重组体DNA和感受态细胞的融合与温育; （3）转化菌的培养和筛选。 第二节 克隆细胞的培养 一.克隆大肠杆菌细胞的培养 感受态大肠杆菌细胞与重组DNA完成转导实验步骤后，立即经过适当地稀释，涂布到培养基平板上，在37℃培养12小时以上，至肉眼观察到菌落形成。即可进行筛选。 培养实验步骤： 制备固体培养基平板； 重组DNA与感受态大肠杆菌细胞一起温育,进行转化； 将转化反应液移至培养基平皿铺板，准备进行培养; 将平皿放入37℃恒温培养箱,首先正向放置20分钟至1小时，使液体消失，然后倒置平皿继续培养12～16小时。 反应液倒至培养基平皿铺板的步骤 (1)感受态大肠杆菌细胞与连接反应产物(重组DNA)旋转混匀后，冰上放置30分钟； (2)42℃水浴静置热休克60秒，取出后立即放回冰中冷激2分钟; (3)无菌状态下加LB液体培养基，37℃摇床振荡培养60分钟，使细菌复苏； (4)将菌液倒至培养基平皿铺板，铺匀后，用加样枪吸去多余的液体。 (5)37℃恒温箱进行培养。 二．转基因植物细胞的培养和处理 植物体细胞具有全能性，植物转基因的受体细胞可利用原生质体、花粉细胞和愈伤组织。