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第七章 目的基因导入受体细胞 第一节 受体细胞 一、原核生物细胞 真菌是低等真核生物，其基因的结构、表达调控机制以及蛋白质的加工与分泌都有真核生物的特征，因此利用真菌细胞表达高等动物基因具有原核生物无法比拟的优点。常用的真菌受体细胞有酵母菌细胞等。 酵母菌是一群以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核微生物。它是外源真核基因最理想的表达系统，其优势是： ① 酵母菌是结构最为简单的真核生物之一，其基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对较为简单。 ② 具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。 ③ 不含有特异的病毒，不产生毒素，有些酵母菌属（如酿洒酵母等）在仪器工业中有着几百年的应用历史，属于安全型基因工程受体系统。 ④ 培养简单，利于大规模发酵生产，成本低廉。 ⑤ 能将外源基因表达产物分泌至培养基，便于产物的提取和加工等。在基因工程研究和应用中，酵母菌具有极为重要的经济意义和学术价值。 三、植物细胞 作为基因转移的受体细胞，植物细胞最突出的优点就是其全能性，即一个分离的活细胞在合适的培养条件下，较容易再分化成植株，这意味着一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的植株或品系。 具有坚硬的细胞壁，可用纤维素酶处理获得原生质体。 四、动物细胞 常用的动物受体细胞有小鼠L细胞、HeLa细胞、猴肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞（CHO）等 以动物细胞，尤其是哺乳动物细胞作受体细胞的优点是： ① 能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪接加工成成熟的mRNA。 ② 真核基因的表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰，产物具有较好的蛋白质免疫原性，约为酵母的16~20倍。 ③ 易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性。 ④ 经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中，便于提纯和加工，成本低。 缺点是组织培养技术要求高，如培养和筛选一个高度扩增的转化子CHO细胞，通常需要数之久，难度较大。 第二节 重组DNA分子 转入生物细胞 一、重组质粒DNA分子转化大肠杆菌 重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化（transformation）。转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。 以革兰氏阳性细菌为例，细菌转化的一种可能机制包括如下基本步骤： ① 细菌感受态的形成。当转化因子接近细菌细胞时，受体细胞分泌一种小分子质量的激活蛋白，又称为感受因子，其功能是与细胞表面特异受体结合，诱导细菌自溶素等特异蛋白的合成，使细菌细胞处于感受态，极易接纳周围环境中转化因子以实现转化。 ② 转化因子的吸收。受体细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性结合，然后激活邻近的核酸酶，将双链DNA分子中的一条链逐步降解，同时将另一条链逐步转移到受体菌内。 ③ 整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链DNA与另一种游离和蛋白因子结合，形成整合复合物前体，它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体DNA处。 ④ 单链DNA转化因子的整合。通过同源重组，置换受体细胞染色体DNA的同源区域，形成异源杂合双链DNA结构。 ⑤ 转化子的形成。受体菌染色体组进行复制，杂合区段亦阻碍之进行半保留复制，当细胞分裂后，该染色体发生分离，形成一个新的转化子。 在大肠杆菌的重组质粒DNA分子，而非采取自然转化的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制备感受态细胞，然后进行转化处理，其中代表性的方法之一是Ca2+诱导的大肠杆菌转化法。 (1) Ca2+诱导大肠杆菌转化法 ① 制备感受态细胞 ② DNA分子转化感受态细胞 由于转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性转化子的出现，因此转化过程中须设以下几种对照处理： DNA对照处理 感受态细胞对照处理 感受态细胞有效性对照处理 （2）电穿孔转化法 其基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔(electro poration),形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA浓度等参数的影响。 一般电穿法孔转化法须在低温下（0℃~4℃）进行，转化效率要比在室温下操作提高约100倍。由于细菌细胞相对较小，因此与DNA导入真核细胞相对比，大肠杆菌的电转化要求有更高的场强，而反应体积则相对较小，以20~40ul为宜。 （3）三亲本杂交接合转化大肠杆菌 三亲本杂交（tri-parenta