第二章基因工程与食品产业四.pptVIP

第二章基因工程与食品产业（四） 重组转化体的筛选和鉴定（筛和鉴） 一、利用表型特征进行筛选(遗传检测法) 表型(phenotype)是指机体遗传组成同环境相互作用所产生的外观或其他特征。 供筛选用的表型特征来自两个方面：一是克隆载体提供的，这是主要的；一是外源DNA提供的，这是次要的。 1、利用载体提供的表型特征进行筛选 (1) 抗药性标记基因插入失活筛选法 对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。 如pBR322中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。 (4) 蓝-白筛选法 它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法，筛选含有编码β-半乳糖苷酶的基因。 β—半乳糖苷酶失活的λ插入型载体的基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段 →编码β—半乳糖苷酶基因lacZ Xgal →蓝色复合物(5-溴-4-氯靛蓝) λ载体感染的大肠杆菌1ac-指示菌 培养基平板 （ IPTG + Xgal ） 形成蓝色的噬菌斑； 如果在lac5区段插入外源DNA，就会阻断β—半乳糖苷酶基因lacZ的编码序列，那么被这种λ重组体感染的1ac—指示菌由于不能合成β—半乳糖苷酶而只能形成无色的噬菌斑 2、利用外源DNA提供的表型特征进行筛选 这种筛选法要求外源DNA是一个完整的基因，而且能够在大肠杆菌或其他受体细胞中实现功能表达。 该法基本原理如下：与载体重组的外源DNA完整基因对大肠杆菌转化宿主菌株表现出外源基因所编码的表型特征；从而与未被转化的菌株分别开。 3、利用噬菌斑的形成进行筛选 以λ噬菌体载体与外源DNA构建的重组体的筛选,主要依赖于重组体的大小及形成噬菌斑的能力。 重组体DNA只有在为野生型λ噬菌体DNA的75％～105％的长度时，才能在培养平板上形成清晰的噬菌斑，而载体DNA本身是不会包装成活的噬菌体颗粒的。 4、利用遗传互补作用进行筛选 如果在转化宿主细胞后，重组体的表达产物可与宿主的营养缺陷型突变发生互补作用，那么根据这种特性，即可筛选出重组转化体。 二、 物理筛选鉴定法 电泳检测法  根据DNA分子量的大小，以凝胶电泳检测重组体。 三、 利用限制性内切核酸酶酶切进行鉴定 将单一细菌进行扩增后分别提取其DNA，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析。 四、 利用核酸杂交进行鉴定 所用的核酸杂交法就是常用的几种核酸杂交法，例如Southern杂交、Nonhem杂交等 （一）、DNA变性与复性 优点：简单、快速、可同时检测多个样品 基因工程在食品科学中的应用 基因工程与动物、植物、微生物产品品质的改良 基因工程与植物产品贮藏保鲜 基因工程与食品新资源的开发 一、基因工程与动物、植物和微生物产品品质的改良 (一) 培育抗病虫害、抗除草剂的植物新品种及抗冻动物新品种的基因工程 1、ICP基因工程 ICP基因来自于苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)。其营养体生长发育到一定阶段后，在其一端形成芽孢，在另一端形成伴胞晶体。伴胞晶体主要由蛋白质和糖类组成。当昆虫吞食伴胞晶体后，在昆虫肠道碱性条件和特定蛋白酶的作用下，伴胞晶体蛋白变成有活性的毒性分子。这种蛋白为δ-内毒素（δ-endotoxin），被称作杀毒结晶蛋白（insecticidal crystal protein, ICP） ICP基因工程 研究进展 培育植物新品种、作物害虫抗性 2、蛋白酶抑制剂基因工程 在自然界中的所有生命体中，尤其在植物中，都含有蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitor，PI)。 蛋白酶抑制剂与昆虫消化道内的蛋白消化酶相结合形成酶抑制剂复合物(EI)，导致蛋白质不能被正常消化；同时EI复合物能刺激昆虫过量分泌消化酶，使昆虫产生厌食反应，干扰昆虫的蜕皮过程和免疫功能 ，使昆虫不能正常发育或死亡。 3、其他抗虫基因工程 转基因番茄的抗蚜虫性能 4、抗病毒病基因工程 外源的病毒外壳蛋白(coatprotein，CP)基因在导入植物细胞后，可能由于其RNA转录体与入侵病毒RNA间的相互作用使植物细胞获得保护 研究人员分