第八章分子生物学研究方法3.pptVIP

4.胚状体再生系统 是指具有胚胎性质的个体。 优点：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力强， 嵌合体少，易于培养、再生。 缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。 5.生殖细胞受体系统 以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的系统。 一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统； 二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。 三、植物遗传转化体系 （一）载体型遗传转化系统 最常见的转基因方法。 将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复制和表达。 农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri质粒(root-indcing?plasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。 农杆菌共培养侵染 诱导愈伤组织 分化生芽 生根 叶盘转化法 (1)叶盘法 双子叶植物较为常用、简单有效的方法。 (2)真空渗入法 将适宜转化的健壮植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中，经真空处理，造伤，使农杆菌通过伤口感染植株，在农杆菌的介导下，发生遗传转化。 简便、快速、可靠，不需要组织培养。 (3)愈伤组织共培养 (4)原生质体共培养 （二）DNA直接转化系统 （1）化学刺激法 细胞融合剂：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVC） 转化顺利，对细胞伤害小； 避免嵌合体的生成； 易于选择； 便于进行理论研究； 受体广泛。 优点： 将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面，借助高压动力射入受体细胞或组织，最后整合到植物基因组并得以表达。 步骤简单易行：适合于大多数细胞或组织，克服了受体材料的限制，不必制备原生质体，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。 (2)基因枪轰击法 （微弹轰击技术micro-projectile bombardment) （3）高压电穿孔法 电击法 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － － － － － 利用高压脉冲作用，在原生质体上形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。 * * 第六节 基因分离技术 一、克隆 多细胞的高等生物个体水平上：表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体，所以说，从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins）便是属于同一克隆。 在细胞水平上：指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。 (教材p.182-187) 1、应用核酸探针分离克隆目的基因 2、应用mRNA差别显示技术分离克隆目的基因 二、克隆基因的分离 3、应用cDNA差示分析法克隆基因 (教材p.184-185) 4、应用酵母双杂交体系克隆基因 5、基因的图位克隆法 (教材p.185-187) 6、DNA的Microarray Infected IBL 2353 Uninfected IBL 2353 7、RACE技术 （1）高质量mRNA的制备 （2）cDNA第一链的合成 （3）cDNA第二链的合成 A. 自身引导法 B. 置换合成法 （4）cDNA的分子克隆 (教材p.183-184) 14 10，670 29 低 230 1，090 49 中 3，500 30 22 高 每个细胞所含的相应丰度mRNA序列的拷贝数（个） 在相应丰度等级中所含的不同种类mRNA序列的数量（个） 相应丰度等级 丰 度 等 级 第七节 核酸序列分析技术 原理：双脱氧（2，3）-核苷酸可以象2-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因3’端不具OH基，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列。 不能和下一个核苷酸通过磷酸二酯键连接起来 一、Sanger双脱氧链终止法 过程：制备ss-DNA→与引物退火→分为4个反应系统→每个系统中加入dNTP（其中dATP常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸→DNA聚合酶定序反应→反应产物变性后电泳→凝胶干燥→放射自显影。 该法亦适合mRNA的序列分析。 GC富集区常出现“隐影”或“停止”现象，如在反应中加入dITP（脱氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸-7-脱氧鸟苷可解决GC富集区的测序。 双脱氧法的特点 需要单链模板、寡核苷酸引物和高质量的DNA聚合酶。 缺点： （1）聚合反应会因二级结构而提前终止，常常测不到准确的DNA序列； （2）由于经模板与引物结合后才能反应并测序，因此对于寡聚核苷酸DNA序列（例如对引物DNA的序列）不