分子生物学实验课件修改版.ppt

实验学时：20 学时 内容安排： 实验一 质粒抽提 实验二 聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段 实验三 DNA酶切鉴定 实验四 DNA片段回收 实验五 重组质粒的连接 实验六 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒 DNA的转化 实验一 质粒抽提 一、实验目的 学习液体培养大肠杆菌的方法； 掌握从大肠杆菌中提取质粒的原理； 释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。 离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。 三、实验试剂及器材 实验器材：电子天平、锥形瓶、气浴摇床、离心 机 实验试剂：溶液I 、溶液II、溶液III、TE、氯仿、 乙醇 五、注意事项 接种环接种菌落时，一定要冷却彻底，否则容易接种失败； 提取质粒过程中，每一步都尽量多吸取溶液，以得到更高的产率； 用TE溶解沉淀的时候，用移液器小心吹打几次即可。 一般细菌中的基因组DNA含量相当高，为什么利用碱裂解法提取出来的大部分是质粒DNA而不是基因组DNA？ 实验二  聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段 掌握PCR的原理； 学会使用PCR仪； 能利用已知序列设计引物进行一般的PCR实验。 这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。 如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。 实验器材：PCR仪、移液器 实验试剂：PCR反应液具体见下页 在加PCR反应体系时，由于涉及试剂较多，容易出现漏加、多加现象，须认真操作，多加注意； 加完反应体系后，应在离心机中稍微离心一下，使所加试剂混匀后再放到PCR仪中反应。 如果让你来设计一段已知DNA序列的上下游引物，应该注意哪些方面？ 实验三 DNA酶切鉴定 二、实验试剂及器材 实验器材：恒温水浴锅、移液器、离心机 实验试剂：ddH2O、10XBuffer、Plasmid、 EcoRI、HindIII 1. 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪按照上面体系加入各种试剂； 2. 混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。 3. 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。 使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低活性； 体系总量比较少，属于微量操作，在移取试剂时需要小心，不要用力过猛，导致溶液喷溅。 只要DNA上存在相应的序列，限制性内切酶都可以作用，为什么限制性内切酶没有对自身细胞中的DNA产生损害呢？ 实验四 DNA片段回收 一、实验目的 学习DNA纯化的原理和方法； 掌握利用试剂盒从凝胶中回收DNA。 实验器材：恒温水浴锅、移液器、离心机 实验试剂：DNA回收试剂盒 切胶时应快速操作，在紫外灯下时间长容易伤害到眼睛； 称胶前一定要先除去离心管的空重 。 DNA纯化的方法主要有哪些？各有什么优点？ 实验五 重组质粒的连接 一、实验目的 掌握DNA连接的原理； 学会用基本的酶切连接的方法。 实验器材：恒温水浴锅、移液器、离心机 实验试剂：DNA连接试剂盒 1、取新的经灭菌处理的0.5ml eppendorf管, 编号。 2、将0.1μg载体DNA转移到无菌离心管中，加等 摩尔量(可稍多)的外源DNA片段。 3、加蒸馏水至体积为8μl,于45℃保温5分钟,以使 重新退火的粘端解链。将混和物冷却至0℃。 　 4、加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混匀后用微量离心机将 液体全部甩到管底,于16℃保温8-24小时。 5、同时做二组对照反应，其中对照组一只有质粒 载体无外源DNA；对照组二只有外源DNA片段没 有质粒载体。 体系总量比较少，属于微量操作，在移取试剂时需要小心，不要用力过猛，导致溶液喷溅； 一般连接4