分子生物学——基因工程操作技术2.pptVIP

* * 复习 理论部分 * * 复习 实践部分 * * 复习 目的基因获取方法？ 质粒？基本性质？表达型质粒具备哪些基因元件？ 基因克隆？ DNA体外重组技术？ 限制性内切酶及其功能？连接酶及其功能？ PCR反应需要的物理过程及化学物质？ 逆转录酶及逆转录PCR过程，cDNA构建步骤？ 感受态细胞？结合？转化？转导？ 基因工程基本操作的四个步骤及其目的？ * 1—5% mRNA，80—85% rRNA，10—15% tRNA。 * 4 这与基因组文库中的单拷贝基因均具有相同的克隆数相较，这是两种文库的另一差别。5（一般选用的载体都是表达型的） 6、Cross-over PCR 例：内含子的删除 Pf-1 Px-intron2 Pr Px-intron2 exon1 First round PCR exon2 Pr Pf-1 Anneal (Second round PCR) RoAmyX 7、Error-prone PCR 8、Real-time PCR 9、 SSH-PCR (suppression subtractive hybridization ) 10、Q-PCR（ Quantitative PCR ） 。。。。。 * PCR应用之目的基因的改造 基因定向突变（site-directed mutagenesis）是进行基因改造最常用的技术。最常用方法是以双链DNA为模板，经加热变性后，与含突变碱基的引物退火，利用PCR方法改变特定碱基，从而将突变碱基引入DNA序列中 * PCR法（ 引物法） 设计引物 分段PCR * * 再次PCR 获得突变基因 * * 6.5 基因的克隆和表达 质粒 表达型质粒载体的结构 * * 6.5.1常用克隆载体 类型：T-载体，pUC系列，pMD系列，一些 表达型质粒 特点：功能单位小，拷贝数多 * * T-vector * * Blue white Screen * * * * 6.5.2 常用表达系统 原核细胞：大肠杆菌、芽孢杆菌等 真核细胞：丝状真菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等 * 6.5.3.原核细胞表达载体 pBV220 、pET等, 多种载体有商品化供应 原核细胞RNA聚合酶可以识别的启动子 原核细胞转录终止子 原核细胞核糖体结合位点 其他调控序列 结构特点 克隆基因在原核生物中表达的必要条件是携带克隆基因的载体具备原核生物中所需要的以下表达调控序列: * 蛋白表达方式 表达产物不仅仅含有目的蛋白，还带有一段融合的其他的标签序列用于检测和纯化。最后应用时，可能需要切除标签部分 非融合表达 表达产物直接是单一目的蛋白 融合表达 * 原核细胞表达系统的优缺点 优点 表达系统简单，容易操作 成本低，易于大量生产 生长周期短 缺点 需要翻译后修饰的蛋白不能用此表达系统 * * 6.5.4真核表达载体 主要包括质粒载体和病毒载体，使用的调控表达元件最初多来源于病毒 * * 真核细胞表达系统的优缺点 表达系统相对复杂 成本高 生长周期长 优点 可表达需要翻译后修饰的蛋白表达系统简单 缺点 6.6 基因表达载体 PgpdA /EcoR I Hygro /Not I TtrpC /BamH I RoAmy /Nhe I EcoR I * 6.7 目的基因到宿主细胞过程 * 感受态细胞（competent cell） 使用理化或化学的方法对受体细胞进行处理或诱导，从而使其处于最适摄取和容纳外来DNA的一种生理状态。 6.7.1 DNA转移过程中的几个概念 1、接合（Conjugation ） Conjugation is the mechanism by which genetic material is transferred between two bacterial cells by plasmids. 发生在原核生物，细胞间的直接接触时候，两个细胞直接接触处形成 conjugation tube，单链 DNA 可以直接通过这个通道转移，这个通道的形成需要有相应的基因表达（如 pilin 形成 sex pilus）。单链转移完毕，供体和受体细胞分别合成互补链，完成 conjugation。 6.7.1 DNA转移过程中的几个概念 2、转化（Transformation ） Certain prokaryotes are able to take up free DNA released by other bacteria. This process is called transformation. （Brock p283 ）