分子生物学第三章--蛋白质大分子结构与功能.ppt

* * * * * * * * Zoom: ctr+shift+mouse Move: ctr+shift 回复突变：突变型生物有时通过遗传物质的变化重新获得其原有表型，被回复的生物称为回复子。 回复突变的原因很多，有一种回复突变是其基因上发生一个突变而引起，称为基因校正突变。大多数基因较正突变发生在tRNA基因上。 * （二） 蛋白质合成的一般过程 可以分为三个阶段： 起始、 延伸、 终止， 分别由不同的起始因子、延伸因子和终止因子（释放因子）参与。 * Fig 14-14 Overview of the events of translation/ribosome cycle * Polysome/polyribosome: an mRNA bearing multiple ribosomes Each mRNA can be translated simultaneously by multiple ribosomes Fig 14-15 A polyribosome * 1、 翻译起始 （1）小亚基与mRNA结合 （2）起始氨酰tRNA进入P位点，其反密码子与mRNA上的起始密码子AUG碱基配对。 （3）大亚基与小亚基结合形成起始复合物。 * 2、 延伸 方向：mRNA 5/ 3/ 新生肽： N/ C/ （1）就位：第二个氨酰tRNA通过密码子—反密码子的配对作用进入核糖体的A位点（氨基位点）。 （2）转肽：在大亚基上肽酰转移酶作用下，A位点氨基酸的α-氨基亲核攻击P位点上氨基酸的羧基并形成肽键，结果两个氨基酸均连到A位点的tRNA上，该过程称为转肽作用，此时，P位点上卸载的tRNA从核糖体上离开。 （3）移位（translocation）：核糖体沿着mRNA移动1个密码子位置，tRNA移位到P位点，A位点空出以便接纳下一个氨基酸。 * 3、?终止 由于终止密码子不能结合任何氨酰tRNA，于是终止因子（又称释放因子）识别并结合到终止密码子上，接着肽转移酶的酯化酶功能转变成水解功能，将肽链从P位点tRNA上水解掉，核糖体释放掉mRNA并解体成大小亚基，翻译结束。 在翻译过程中除了核糖体大小亚基、 mRNA和氨酰tRNA外，还需要GTP和许多蛋白辅助因子。这些辅助因子有的起催化作用，有的起改变和稳定构象作用。 * 4、翻译后加工 一些肽链翻译完成后，能直接折叠成最终的活性形式，不需加工修饰。 然而许多新生肽链需要翻译后加工或修饰,包括：（1）切除部分肽段（蛋白酶），例如，酶原激活 （2）在特定氨基酸残基侧链上添加基团（共价修饰），例如糖基化、羟基化 （3）插入辅因子，还有些单肽要聚合折叠成多亚基蛋白。 * 分子伴侣（Molecular Chaperones）  定义：与新生肽链形成复合物并协助它正确折叠成具有生物功能构象的蛋白质，协助多肽链跨膜转运以及多亚基蛋白质的组装和解体，但它不属于新生肽链的组成部分。 在原核表达时使用分子伴侣，减少包涵体的形成 * 包涵体-蛋白表达时的双刃剑 包涵体是指细菌表达的重组蛋白在细胞内凝集，形成无活性、不溶性的固体颗粒。包涵体的存在常使得细胞破碎后很浑浊。包涵体中一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等. * 包涵体的形成原因 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。 * 包涵体表达的有利因素 1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。 * 提高目的蛋白的可溶