医学分子生物学-上课用-7基因结构与表达分析方法.pptVIP

一种水解式荧光标记探针。寡核苷酸探针的5′端标记一个荧光报告基团（reporter ），3′端标记一个荧光淬灭基团（quencher ）。 每产生一条DNA链，就切断一条探针，每切断一条探针，就产生一个单位信号，信号强度与结合探针的DNA分子数成正比。 * 荧光强度与模板呈正比，故可用于PCR产物的定性及定量分析。 * 制备细胞：多聚甲醛固定、蛋白酶K消化。 原位RT-PCR：地高辛标记、RT-PCR。 产物检测：与地高辛抗体杂交。 * DNA微阵列： ● 寡核苷酸微阵列（oligomicroarray） ● cDNA微阵列（cDNA microarray） 在一微小的基片（硅片等）表面集成了大量分子识别探针，能够平行分析大量基因转录表达，因此又被称为cDNA芯片。 * Western blotting原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质分子。 * * HGP的提出，让人们对基因的序列和功能特别好奇，促使各种测序技术的发展。 * 最常用的测序方法，一次能确定300-500bp序列，操作简便，结果清晰可靠。 * PAGE：polyacrylamide gel electrophoresis。 基于DNA的合成。 * 四种碱基的平均分子量是324。 * * 操作繁杂，所用的化学试剂多为有毒物质，且无法进行自动化分析，故很少有人再使用。 * 传统的测序技术耗时、效率低，推进了大规模高通量的自动化测序技术。 * 用四种不同的荧光化合物标记ddNTP * 这是计算机打印结果 * ddNTP实际就是终止物。 * 转基因动物植物检测需用到Southern杂交。 亲子鉴定 * 是根据核酸的变性和复性的性质，应用核酸探针检测靶基因或靶序列的技术方法。具有灵敏度高、速度快、简便易行的优点。 * 常见的固相支持物：硝酸纤维素膜、尼龙膜（nylon membrane）：、化学活化膜：聚氟偏乙烯膜（ PVDF膜）。 转移方法：虹吸印迹法、真空转移法、电转移法、直接点样法。 * 将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。用于DNA定性定量分子，基因突变分析，及RFLP分析等。 * 主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平，或比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。 * 缺点：不能确定所测基因或基因片段的分子质量大小，特异性不高，有一定比例的假阳性。 * 菌落原位杂交：1.将转化后得到的菌落或噬菌斑原位转移到NC膜上，得到一个与平板菌落或噬菌斑分布完全一致的复制品 2.原位裂解细胞，碱变性，核酸分子被固定于膜上 3.加入标记的DNA或RNA探针进行杂交 4.含有与探针互补序列的菌落或噬菌斑经放射自显影后，在X光底片上出现杂交点。 5.根据阳性反应位置，可从保留的母板上挑出所需的阳性克隆。 * 利用M13噬菌体合成放射性的ssDNA探针。 探针与待测RNA样品在液相中进行杂交，形成DNA/RNA。核酸酶S1能专一 性地降解未形成杂交的DNA和RNA单链，不降解DNA/RNA双链。 酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，在8 mol/L脲-聚丙烯酰胺凝胶中分离，放射自显影。 * 目的：检测RNA，可用于mRNA的定量分析，比Northern杂交灵敏度更高。 原理：探针为ssRNA，杂交后形成RNA/RNA，RNA酶A和T1专一性地降解ssRNA，而dsRNA不被降解。 酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，在8 mol/L脲-聚丙烯酰胺凝胶中分离，放射自显影。 * * 原理：PCR是模拟天然DNA复制过程，利用DNA 聚合酶催化一对引物间特异DNA片段合成的体外扩增技术。 其主要热循环过程为：变性、退火、延伸三个步骤。 * * 引物延伸产物：比两引物限定区长的延伸产物。仅仅发生在以原始模板DNA为模板的扩增过程中，以倍数形式扩增（2n）。 * 引物延伸产物量很少，检测不到。 早期在PCR中使用的使大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段——klenow片段，延伸温度为37度，但在95°完全失活。也由于其反应温度低，使非特异性产物增多。 Taq DNA聚合酶从嗜热水生菌thermus aquatics YT-1株中直接分离出来。 * 引物的化学本质是什么？ PCR引物：单链DNA片段 DNA复制引物：单链RNA片段 * * 3’不选A，选A的话错配情况下依然可以延伸？ * 5’端可以加数10个碱基进行修饰 * AMV：鸟类成髓细胞性白血病病毒 MMLV：莫罗尼鼠类白血病病毒 * QRT-PCR：是当前定量分析基因表达的一种最快速敏感的方法。 * 荧光探针必须完全与靶基因互补，20-30