2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.ppt

从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 “微生物的天然培养基” 数量最大、种类最多 大约70%—90%是细菌 土壤取样 1 制备选择培养基（尿素为唯一氮源） （对照作用） 制备牛肉膏蛋白胨培养基 ①从物理性质看此培养基属于哪类？ 从功能上属于哪类培养基？ 固体培养基 选择培养基 ②此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素 ◆应在火焰旁称取土壤10g。 ◆在稀释土壤溶液的过程中每一步都要在火焰旁进行。 ◆分离不同的微生物采用不同的稀释度。 （1）测细菌数：一般用104、105、106稀释液 （2）测放线菌：一般用103、104、105稀释液 （3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液 原则：确保平板上的菌落数在30～300之间。 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？ 原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。 取0.1ml菌悬液 高浓度→低浓度，换枪头 低浓度→高浓度，可不用换枪头 接 种 ◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。 涂布分离 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：30～37℃培养1～2d； 放线菌：25～28℃培养5～7d； 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。 恒温培养箱 按浓度捆成一摞 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。 1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。 2.提示：选择每个平板上长有30-300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。 结果分析与评价 课外延伸 鉴定： 鉴别培养基：不影响微生物的生存。 酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性 操作：挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否变红。 学习目标 新课导入 课题背景知识 1 筛选菌株 2 基础知识 统计菌落数目 3 课题背景知识 1 筛选菌株 2 统计菌落数目 3 土壤取样 1 制备培养基 2 样品的稀释 3 取样涂布 4 实验设计 微生物的培养与观察 5 设置对照 4 制备培养基 2 样品的稀释 3 取样涂布 4 微生物的培养与观察 5 自我检测 课题2：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1、尿素 尿素是一种重要的农业氮肥，不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。 2、细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 CO(NH2) 脲酶 + H2O + CO2 NH3 基础知识 3、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。 4、课题目的 ①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 基础知识 要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等； 方法：⑴抑制大多数微生物不能生长； ⑵造成有利于该菌生长的环境。 结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。 实验室中微生物的筛选原理： 培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。 培养基选择分解尿素的微生物的原理 1、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。 基础知识 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察； 缺点 2、间接计数法（活菌计数法） 常用方法：稀释涂布平板法。 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×