金黄色葡萄球菌多重PCR和基因芯片检测方法的建立.pdfVIP

目 录 1. 绪论 1.1 金黄色葡萄球菌 4 1.1.1 金黄色葡萄球菌的生物学特性 4 1.1.2 金黄色葡萄球菌的危害 4 1.1.3 金黄色葡萄球菌的毒力因子 5 1.2 金黄色葡萄球菌检测方法及研究进展 6 1.2.1 传统生化检测法 6 1.2.2 免疫学方法 7 1.2.3 分子生物学方法 8 1.3 用于金黄色葡萄球菌检测的常见基因 9 1.3.1 金黄色葡萄球菌属特异性基因 9 1.3.2 金黄色葡萄球菌的抗生素抗性基因 9 2. 金黄色葡萄球菌多重 PCR 检测方法的建立 12 2.1 材料 12 2.1.1 实验菌株 12 2.1.2 主要试剂及仪器 13 2.1.3 引物选择 13 2.2 方法 14 2.2.1 DNA 的制备 15 2.2.2 引物特异性验证 15 2.2.3 PCR 反应体系的优化 15 2.2.4 灵敏度试验 16 2.2.5 抗干扰试验及人工污染试验 16 2.2.6 多重PCR方法有效性验证 16 2.3 结果 17 2.3.1 PCR 反应体系的优化 17 2.3.2 引物特异性验证 18 2.3.3 DNA 灵敏度 19 2.3.4 抗干扰试验及人工污染试验 20 2.3.5 多重PCR方法的验证 20 2.4 讨论 21 3. 金黄色葡萄球菌基因芯片检测方法的建立 24 3.1 概述 24 3.1.1 基因芯片的原理 24 3.1.2 制作基因芯片的技术 24 3.1.3 基因芯片在致病菌检测方面的应用 26 3.2 材料 27 3.2.1 供试菌株 27 3.2.2 仪器设备 27 3.2.3 芯片引物与探针 28 3.2.4 试剂 31 3.3 方法 32 3.3.1 DNA 提取 32 3.3.2 多重PCR的反应体系 32 3.3.3 PCR 产物纯化 32 3.3.4 点制芯片 32 3.3.5 芯片杂交和洗片 33 3.3.6 芯片扫描和数据分析 34 3.3.7 PCR 退火温度和荧光标记温度优化 34 3.3.8 芯片检测特异性 34 3.3.9 芯片检测灵敏度 34 3.4 结果与讨论 34 3.4.1 PCR 退火温度和荧光标记温度优化 34 3.4.2 芯片检测特异性 35 3.4.3 芯片检测灵敏度 36 4.总结与展望 38 参考文献 40 致谢 48 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 49 表格目录 表 1金黄色普通球菌及其甲氧西林和肠毒素分布 9 表 2 引物序列及产物大小 11 表 3 金黄色葡萄球菌肠毒素与抗性分布分析表 18 表 4 实验中所用菌株 23 表 5 试验所用芯片引物和探针序列 25 表 6 基因芯片每个重复区域的探针点样位置 26 图片目录 图 1 退火温度的 PCR电泳图 14 图 2 多重 PCR 检测金黄色葡萄球菌的 Mg2+浓度梯度电泳图 14 图 3 金黄色葡萄球菌各引物单独 PCR 和多重 PCR 引物验证的电泳图 15 图 4 多重 PCR 检测金黄色葡萄球菌 DNA 浓度梯度电泳图 16 图 5 溶血葡萄球菌和表面葡萄球菌的多重 PCR电泳结果 17 图 6 基因芯片的特异性验证 30 图 7 金黄色葡萄球菌 05G064 芯片检