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铜陵中山医院实验室微生物操作sop文件 支原体培养鉴定及药敏操作规程 1.目的 支原体是缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，也是目前所知能在人工培养基中生长繁殖的最小微生物，呈多形态性，基本为球形，亦可呈球杆状或丝状，可通过除菌滤器。支原体种类繁多，分布广泛，已分离到150多种，而人体支原体至少有15种，其中对人类有致病作用的主要有：肺炎支原体、解脲脲原体、人型支原体和生殖道支原体。在这里主要是介绍解脲脲原体和人型支原体的培养检测程序。 2.范围 采集生殖道或尿道标本检测解脲脲原体和人型支原体。适用于尿液、尿道分必物、前列腺液、精液和宫颈分泌物等。 3.培养程序 3.1形态与培养特性 支原体没有细胞壁，形态多形性，但主要有三种基本形态：球形、双球形和丝状。革兰染色阴性，但不易着色，姬姆萨染色着色较好，呈淡紫色。支原体营养要求较高，一般以牛心浸液为基础，再添加10%~20%的动物血清及10%的新鲜酵母浸液。支原体最适pH为7.8～8.0，低于pH 7.0则死亡，一般为兼性厌氧菌，个别菌种为专性厌氧菌。该菌生长缓慢，在支原体培养基中典型菌落呈“油煎蛋”样，其中以肺炎支原体的菌落最大，解脲脲原体的菌落最小，宜在低倍镜下观察。支原体在液体培养基中生长量较少，一般不易浑注。 3.2程序步骤 3.2.1标本取样后立即送检，必须在2h以内接种，2～8℃保存不超过5h，尿液标本应在膀胱内停留2h以上，新鲜标本取10ml经3000r/min离心15min对样本进行浓集后取0.2ml.沉淀进行培养。 3.2.2试剂盒放置至室温后，在编号区标上编号，取出试剂，将稀释液加到培养基干粉瓶的2.9ml标线处，摇匀待干粉完全溶解后吸50ul到C-孔，作为阴性对照孔。 3.2.3将拭子或样本（尿液或液体标本取离心后的沉淀0.2ml）加入培养液中， 拭子应稍加用力挤压旋转数次，使样本充分溶解于培养液，弃拭子，用移液器分别吸50ul培养液加入余下各孔中，然后每孔滴加二滴无菌液状石蜡，盖上盖， 置35～37℃孵箱中培养，分别于24h观察解脲脲原体和48h观察人型支原体的培养及药敏结果。 3.2.4结果判读，阴性对照孔培养液淡黄清亮，支原体培养孔颜色由黄变红，表明有支原体生长(“+”)，不变色（黄色）表明无支原体生长（“一”）；阴性对照孔：红色(+)，表示污染，试验无效；阴性对照孔：黄色（一），试验有效。药敏结果：两管均为黄色为敏感；两管均为红色为耐药；低浓度管红色而高浓度管黄色为中度敏感。培养及药敏结果分别见下表 试剂孔名 反应结果 反应结果 反应结果 反应结果 反应结果 反应结果 阴性对照 黄色 黄色 黄色 黄色 黄色 黄色 阳性对照 黄色 红色 红色 红色 红色 红色 Uu生长 黄色 黄色 红色 红色 黄色 红色 Mh生长 黄色 黄色 红色 黄色 红色 红色 Uu≥104 黄色 黄色 黄色 红色 黄色 红色 Mh≥104 黄色 黄色 黄色 黄色 红色 红色 意义 无支原体生长 有其他支原体生长 有104Uu和Mh生长 解脲脲原体≥104 人型支原体≥104 Uu和Mh浓度≥104 解脲脲原体的人型支原体药敏结果判读 孔名 反应结果 反应结果 反应结果 低浓度药物孔 黄色 红色 红色 高浓度药物孔 黄色 黄色 红色 药敏结果 敏感 中敏 耐药 4.注意事项 4.1 Uu的培养和药敏结果必须在24h判读，Mh的培养和药敏结果必须在48h判读。 4.2支原体生长应保持培养基透明清亮，遇杂菌污染引起浑浊变红者不得报告支原体阳性结果（但部分含分泌物较多的样本接种到培养基中可能引起培养基澄清 度降低，要注意区别），应要求临床重新留取标本送检。 4.3人型支原体和解脲脲原体由于细胞壁缺损，天然耐受所有β-内酰胺类、磺胺嘧啶、甲氧苄啶和利福平类抗生素。对大环内酯类和林可霉素类药物的耐药性因菌株而有差异。人型支原体对红霉素耐药，而对克林霉素敏感，但解脲脲原体则与之相反。 4.4支原体结果判读方面，不典型颜色如为橙黄色应判为阴性，橙红色则应判为阳性。 5.临床意义 5.1 Uu和Mh在女性生殖道为条件致病菌，感染浓度10 000时，感染的危险性高，应结合患者的临床症状进行判断。 5.2支原体可引起急性尿道综合征、非淋菌性尿道炎、肾盂肾炎、阴道炎、盆腔炎、不育症、死胎、早产及出生低体重儿等。 6.生物安全警示 使用后的培养基和试剂条应作为有潜在传染风险的废弃物处理，进行高压灭菌后再做下一步处理。 参考文献 [1] 支原体培养—鉴定一药敏试剂盒使用说明书，珠海丽珠试剂． [2] 叶应妩，王毓三，申子瑜主编．全国临床检验操作规程．第三版．南京：东南大学出版社，2006 [3] 周庭银，赵虎．临床微