第8章外源基因在哺乳动物细胞中的表达.ppt

A 高等哺乳动物基因工程的基本概念 B 高等哺乳动物的受体系统 C 高等哺乳动物的载体系统 D 高等哺乳动物的基因转移 E 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白 D 高等哺乳动物的基因转移 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊 方式。氨甲喋呤（MTX）是动物细胞中的关键代谢酶二氢叶酸还原酶 数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因均得以扩 增。这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶 通过强化基因扩增高效表达外源基因 （DHFR）的特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲喋呤处理后，绝大多 的表达水平，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。更重要的是，扩增的区 哺乳动物细胞内的基因扩增现象 域远远大于dhfr基因本身，即与dhfr基因相邻的DNA区域同时被扩增。 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 通过强化基因扩增高效表达外源基因 DHFR-MTX高效表达系统 外源基因 dhfr 转染dhfr -细胞系 单克隆 培养 转移 0.05 mM MTX 培养 单克隆 转移 培养 单克隆 转移 5 mM MTX 0.25 mM MTX 培养 单克隆 外源基因扩增至100拷贝 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 通过强化基因扩增高效表达外源基因 GS-MSX高效表达系统 谷氨酰胺合成酶（GS）能解除甲硫氨酸亚砜（MSX）对动物细 胞的毒害作用。先将带有GS编码基因的载体转入培养的哺乳动物细 中不必使用GS缺陷型的受体细胞，而且在正常的MSX浓度下就能筛 选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是GS-MSX系统比DHFR- 胞中，由于只有多拷贝的GS编码基因才能抗MSX，所以在转染过程 MTX系统优越之处。 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 通过强化基因转录高效表达外源基因 在载体上安装病毒或细胞来源的强启 Ap r M13 ori ColE1 ori CMVP Polylinker Gene Intron SV40 T PolyA signal 高效表达载体 mRNA前体 AAAAAAAAA mRNA 动子以及有效的翻译元件，也是使外源基 因高效表达的一种手段，如： 细胞巨化病毒CMV的启动子 动物珠蛋白基因的内含子 SV40的终止子和polyA化信号序列 绝大多数哺乳动物细胞的表达型载体 上携带内含子结构，因为mRNA前体的剪 切能促进成熟mRNA向胞质的运输，有利 于翻译。有的还含有各种信号肽序列。 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 利用哺乳动物工程细胞生产的重组蛋白 迄今为止，已有大约300种重组蛋白药物正在进行临床试验，但 在哺乳动物工程细胞中大规模生产的只有少数几种： b 干扰素 g 干扰素 凝血因子VIII 凝血因子IX 促红细胞生成素（EPO） 生长因子（hGH） 白介素 2（IL-2） 乙型肝炎表面抗原 单克隆抗体 CD4受体 组织型纤溶酶原激活剂（tPA） 利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体 大多数恶性淋巴 Neor 鼠金属硫蛋白启动子 b 肌动蛋白启动子 抗体轻链cDNA b 肌动蛋白终止子 pL dhfr SV40启动子 b 肌动蛋白启动子 抗体重链cDNA b 肌动蛋白终止子 pH 瘤细胞表面上都 有一种特异性的 糖蛋白campath 用人源化的小鼠 抗campath抗体 治疗非霍金淋巴 细胞瘤患者，效 果良好。重组抗 体采用DHFR-M TX系统表达。 利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂 第一个由重组哺乳动物 dhfr 启动子 人tPA cDNA 终止子 细胞规模化生产的医用蛋白 是治疗急性心肌梗塞的溶血 栓药物：人组织型纤溶酶原 激活剂（tPA）。同样采用 DHFR-MTX系统表达，受体 细胞选用CHO系统。目前， 用该工艺路线生产的重组人tPA已经商品化。 信号肽编码序列 此外，人tPA也可由重组大肠杆菌生产，但蛋白的重折叠效率低。 8 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 高等哺乳动物基因工程 高等哺乳动物细胞基因表达技术 高等哺乳动物转基因技术 转基因动物个体 动物工程细胞 哺乳动物遗传性状改良 药物筛选研究评价模型 人体基因治疗 蛋白多肽物质大规模生产 药物筛选研究评价模型 8 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 高等哺乳动物细胞的生长特性 高等哺乳动物受体细胞的条件 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 常用的高等哺乳动物受体细胞 高等哺乳动物细胞的生长特性 正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征：