共聚焦显微技术.pdfVIP

共聚焦显微技术 魏峥 连奔 [摘要]共聚焦显微技术属于近十几年迅速发展起来的一项高新研究技术, 目前的应用范围扩展到细 胞学、微生物学、发育生物学、遗传学、神经生物学、生理和病理学等学科的研究工作中, 已成为现 代生物学微观研究的重要工具。共聚焦显微技术按照显微镜构造原理的不同分成激光扫描共聚焦和 数字共聚焦显微技术两种。共聚焦技术具有成像清晰、获得三维图像、进行多标记观察、活细胞内 动态生理反应的实时观察记录、定性定量分析等优势，可以应用于亚细胞水平中观察离子水平的变 化并结合电生理等技术观察细胞生理活动与细胞形态及运动变化的相互关系等。 [关键词] 激光共聚焦 数字共聚焦 免疫荧光标记 光谱拆分 FRAP FLIP FRET 共聚焦显微技术是在荧光显微分析技术的基础上发展起来的, 利用荧光显微镜可以对生物样品 发出的荧光进行观察和分析, 但是荧光显微镜收集到的是样品的整体荧光, 来自样品内不同部位的 荧光信号相互干扰, 难以区分, 无法获得准确的定位和定量信息。共聚焦显微技术的出现很好地解决 了这一问题, 这一技术可以获取细胞内某个薄层面上的荧光信息, 而该层以外的信号被消除掉, 成像 清晰程度大大提高; 结合计算机自动控制, 可以对荧光信号的分布、强度和动态变化进行全方位的分 析, 得到丰富的信息。 与传统显微镜相比共聚焦显微镜可抑制图像的模糊，获得清晰的图像；具有更高的轴向分辨率， 并可获取连续光学切片；增加侧向分辨率；由于点对点扫描去除了杂散光的影响。 （一）共聚焦显微镜的原理 Confocal 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来 自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测 针孔内，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来 说是共轭的，因此被探测点即为共焦点，被探测点所在的平面即为共焦平面。计算机以像点的方式 将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上 扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着 Z 轴上下移动，将样品新的一个层面移动到 共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着 Z 轴的不断移动，就可得到样品不同层面的连 续光切图像。 （二）共聚焦的两种实现方式 1.激光扫描共聚焦 这种共聚焦技术利用激光作为激发光源,将激光聚焦于 样品中的某一点, 这样只有该点附近的 区域有荧光, 其他没有被激发的部位没有荧光, 这一区域发出的荧光反射到光电倍增管, 在光电倍增 管前设有 1 个计算机控制的可调节针孔, 保证只有被激发点发出的荧光才能到达光电管, 而附近其 他点所发出的荧光被挡在视野之外。采用计算机控制激光和针孔, 对细胞内的某一层面进行扫描, 可 以获得清晰的二维图像。 这一技术成像速度快、自动化程度高。但激光具有单色性, 一种激光器只能发出某几个特定波长 的激光,而荧光染料的种类很多, 其激发光波长各不相同, 这样在使用某种型号的激光器时, 只有少 数几种荧光染料可以使用, 而其他大多数的染料不能使用; 目前同时配备数个不同激光器或多光子 脉冲激光器的激光共聚焦系统的出现, 虽然可以解决这一难题, 但是设备结构复杂、价格昂贵, 维护 保养要求较高。 2.数字共聚焦 这一技术是随着计算机软件技术的发展出现的, 与激光共聚焦的原理有极大的区别, 它在普通 的荧光显微镜上加上 1 个计算机控制的高分辨率、带有制冷装