生物化学dna重组技术概述.ppt

DNA重组技术前言 （1）I型限制酶属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNA两种特性。 功能 核酸内切酶甲基化酶ATP酶DNA解旋酶 特点： 识别和切割位点不一致 没有固定的切割位点 随机切割 不产生特异片段  应用1.催化DNA切口平移反应，置备高比活DNA探针。(大肠杆菌DNA聚合酶I） DNaseI DNA聚合酶I dNTP 32P-dNTP 2.对DNA分子进行末端标记（Klenow） 2 .Taq DNA聚合酶(1)特性： ①耐热的DNA聚合酶来自于嗜热的栖热水生菌Thermus aquaticus 中纯化而来的。 ②5’?3’聚合酶活性  ③5’?3’外切酶活性 ④最佳作用温度为75-80?C （2）用途①通过PCR对DNA分子的特定序列进行体外扩增 ②对DNA进行测序 3.反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶，RDDP）（1）特性①催化从RNA为模板的DNA聚合反应 ②具3’?5’RNA外切酶活性，能特异性降解RNA— DNA杂交分子中的RNA部分 ③具DNA指导的DNA聚合酶（DDDP）的功能 ④能以mRNA为模板催化合成出互补的DNA（cDNA）  （2）分类 ①禽源反转录酶 来自禽或骨髓细胞瘤病毒（AMV）  具有聚合酶活性及强的RNA酶H活性  无3’?5’外切酶活性。 温度42?C  pH8.6时活性较高 ②鼠源反转录酶 来自Moloney鼠白血病病毒（M-MLV）具有聚合酶活性及相对较弱的RNA酶H活性 无3’?5’外切酶活性 温度37?C pH7.6时活性较高  4.末端脱氧核糖核酸转移酶（末端转移酶） 催化dNTP加到DNA分子的3’羟基端 * * DNA重组技术概述邓益斌  一、重组DNA技术的诞生（一）重组DNA技术诞生的理论基础 1.40年代明确了遗传的物质基础是DNA （肺炎链球菌） 2、50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制 3、50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码。中心法则 遗传密码 64个密码子 61个代表各种氨基酸（AUG起始密码） 3个密码子为终止子（UAA、UAG、UGA） 操纵子 用基因表达调控的原理解释了酶诱导的本质。 （二）关键性实验技术问世为重组DNA技术奠定基础 1.DNA分子的切割与连接技术?? 2.载体构建和大肠杆菌转化体系的建立 3.Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链式反应 二.重组DNA技术的定义及意义（一）重组DNA技术1、重组DNA技术（recombinant DNA technology): 按照人的意愿，在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝，表达相关基因的产物，是进行基因功能研究的基本方法。 2.克隆（clone):指由一个细胞通过无性繁殖以后形成的与亲代完全相同的子代群体。 分子克隆（molecular cloning）： 构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无 性繁殖体系。 （二）重组DNA技术的重大意义 1.填平了生物种属间不可逾越的鸿沟。 2.缩短了进化时间。 3.使人能对生物体进行定向构造。 三、工具酶（一）限制性核酸内切酶是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。 1.分类 根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为： I型 II型 III型 （2）III型酶与I型酶特性类似，也有甲基化功能，但无ATP酶和DNA解旋酶活力。在DNA链上有特异位点切割，其切割位点在识别位点以外。（3）II型酶 2. II型酶（1）II型酶的识别 识别序列一般为4-6个碱基对，通常是反转重复顺序，具有180o的旋转对称性。（2）II型酶的切割功能★平末端（blunt end) 在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割。 ★5’端粘性末端（cohesive end) 在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5’末端切割。 ★ 3’端粘性末端 在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的3’末端切割。 （3）少数有特殊性质的II型酶1异源同工酶（isoschizomer） 定义： 来源不同但能识别和切割同一位点的酶。 5’ C C G G 3’ 3’ G G C C 5’ 5’