第五章分子生物学研究方法220120411.pptVIP

第五章 分子生物学研究法（上） ——— 基因克隆筛选策略 基因克隆 专题一：序列已知基因的克隆策略 专题二：序列未知基因的克隆策略 专题二：序列未知基因的克隆策略 5.6 构建基因组文库 5.7 构建cDNA文库 5.9 RACE 5.10 反向PCR 5.11 Tail-PCR 5.12 基因的图位克隆法 5.6 基因组DNA文库构建 把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆（理论上每个序列至少有一个代表），这样的克隆片段的总汇，称为基因组DNA文库。 5.7 cDNA文库的构建 1 总RNA的提取 2 mRNA的纯化 3 cDNA的合成 4 cDNA文库的构建 总RNA的抽提方法 异硫氰酸胍-苯酚抽提法(TRIzol法) 硅胶膜纯化柱 2 mRNA的纯化 5’端帽子结构和3’端的polyA尾巴 寡聚(dT)-纤维素柱色谱法 3 cDNA的合成 5.8 基因文库的筛选 基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。 筛选的方法有很多种，如酶活检测法、核酸杂交法，PCR筛选法和免疫筛选法等。 1、酶活检测法 获得代谢某种物质的能力 显色反应 蛋白活性容易检测 5.9 RACE技术 RACE (Rapid amplification of cDNA ends)：在已知cDNA序列的基础上克隆5’端或3’端缺失序列的技术。 一般分5’-和3’-RACE两种。 已知cDNA序列可来自序列表达标签、减法cDNA库、差法显示和基因文库筛选。 3’-RACE较简单，首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，根据一般基因具有polyA尾巴的特点，选用特异引物(根据已知序列设计)和PolyT引物PCR即可。 5’-RACE相对较难，目前流行几种5’-RACE。其一为加接头(传统)，根据接头引物和自己设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩增。另外，有利用反向PCR技术，连接成环再PCR。 Inverse PCR或Reverse PCR 扩增一段已知序列旁侧的DNA 序列的方法 Fig. 11 Southern blotting analysis of EcoR I and Hind III digested total DNA from LN146 5.11 Tail-PCR Thermal Asymmetric Interlaced PCR，即热不对称PCR，又叫巢式PCR，是一种染色体步移技术（Genome Walking）。 通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环，利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段，所获得的片段可以直接用做探针标记和测序模板。 Tail-PCR应用实例 Fig. 7 Genomic of Bacillus sp. LN146  Fig. 11 Tail-PCR amplification of the α-acetolactate synthase gene 程序 1、建立目的基因的遗传分离群体 2、找到与目的基因紧密连锁的分子标记 3、用遗传图或物理作图将目的基因定位在染色体特定位置 4、构建含有大插入片段的基因组文库 5、以与目的基因连锁的分子标记为探针筛选文库 6 、用阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群 7、通过染色体步移获得含有目标基因的大片段克隆 8、通过亚克隆获得目标的小片段克隆 9、通过遗传转化和功能互补验证，最终确定目标基因的碱基序列 存在的问题 1、需要有精确的遗传图谱 2、遗传图谱上离目的基因很近的分子标记在物理图谱上还相距甚远 3、高等植物基因组极其复杂，存在大量重复序列，在实际操作中会遇到走不动的难题。 其它重要方法 5.13 实时荧光定量 PCR 5.14 Gateway大规模克隆技术 5.13 实时荧光定量 PCR (Real time quantitative PCR) PCR可以用来定量吗？ 荧光探针的使用 实时荧光定量 PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。 与普通PCR的区别 普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。 实时定量PCR技术： 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。 Ct值和荧光阈值 Ct值是扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。 荧光阈值(threshold value)是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上。 Ct值和荧光阈值 定量PCR的数学原