农杆菌感触感染态的制备及电击转化.doc

农杆菌感受态的制备及电击转化 （1） 将农杆菌EHA105菌株在含有50 mg/l 利福平的LB固体培养基上划线，28℃培养36~48 h； （2） 挑取单克隆，于10 ml 含50 mg/l 利福平的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜； （3） 当OD600达到0.5~0.7时，6 000 r/min 4℃离心10 min收集菌体； （4） 用预冷的10%无菌甘油洗菌体3次后用2 ml预冷的10%无菌甘油重悬沉淀，分装后于-70℃保存备用； （5） 取重组质粒（pROK2-LbDREB）1 μl，加入100 μl EHA105感受态细胞，混匀后冰上放置； （6） 将混合液放入预冷的电击杯中，1 800 V电击； （7） 电击完成后迅速取出，加入500 μl LB液体培养基，迅速吸打混匀，尽可能多的将混合液移入无菌的离心管中，28℃摇菌1 h复苏； （8） 取适量菌液涂布于含50 mg/l 卡那、50 mg/l 利福平的LB固体培养基上，28℃培养36~48 h； ①农杆菌感受态细胞制备 a. 在新活化的农杆菌EHA105/GV3101平板上，挑取单克隆于LB液体培养基（含利福平50mg/l）中，28℃，220r/min振荡培养至OD600达到0.6-0.7； b. 取1.5ml无菌离心管，每管分装1ml菌液，6000r/min离心10min； c. 去除上清，用1ml 10%无菌甘油重悬菌体，6000r/min离心10min，重复此过程3次，充分洗涤菌体以去除残留的培养基； d. 向洗好的菌体用100μl 20%无菌甘油重悬，-70℃保存备用。 ② 根癌农杆菌的电击转化 a. 取-70℃保存的农杆菌感受态细胞，加入100ng重组质粒（pCAM-EG），吸打混匀后移入预冷的电击杯中； b. 1800V电压电击后迅速取出电击杯，加入500μl LB液体培养基，迅速吸打混匀； c. 尽可能多的吸出电击杯中的培养基，移入到无菌1.5ml无菌离心管中，28℃，振荡培养1h； d. 取转化的菌液200μl涂布于LB固体培养基（含利福平50mg/l和卡那霉素50mg/l）平板，28℃倒置培养24-48h。 农杆菌感受态制备 准备工作：（能灭菌的都灭菌） 菌种：EHA105 GV3101 10%甘油100ml、20%甘油10ml、LB液体培养基100ml、利福平、冰 100ml三角瓶、1.5ml离心管、各型号枪头、4℃离心机 步骤： 农杆菌于LB(或YEB)含利福平50mg/L，28℃，220rpm振荡培养至OD600达到0.6-0.7为宜。 取1.5ml无菌离心管，每管分装1.5ml菌液，6000rpm，10min。 去上层培养基，用10%无菌甘油洗3次。 向洗好的菌体沉淀中加100ul 20%无菌甘油，-80℃保存备用。 电击转化农杆菌 准备工作：（能灭菌的都灭菌） 电击杯、1.5ml离心管、感受态农杆菌、LB固体液体培养基、卡那、利福平 步骤： 电激转化：电击杯冰上放置5min预冷，质粒100ng加入100ul感受态农杆菌中，吸打混匀后移到预冷的电击杯中，1800V电压（上下键同时按来选择电压），双击pulse 2X键，约5-6s，听到蜂鸣声，屏幕显示CH9，迅速取出，加入500ul不含抗生素的LB（或SOC）液体培养基，迅速吸打混匀。 摇菌复苏：尽可能多的吸出电击杯中的培养基，移到无菌1.5ml离心管中，28℃培养1h复苏菌体。 涂平板；铺制LB固体培养基平板，含Rif50mg/L及相应抗生素，取适量菌液（100-200ul）涂布。 28℃培养约48h。 注：电击杯冰上预冷至少5min，用完浸于75%乙醇。 利福平（Rif）可先用4M NaOH3-4滴溶解，再用水定容，也可用几滴甲醇溶解再定容。配成10或20mg/ml即可。