抗体制药2.ppt

动物体内诱生法制备的McAb纯化的一般程序 （1）澄清和沉淀处理 * * * * 　 中国.中学政治教学网崇尚互联共享 * 　 中国.中学政治教学网崇尚互联共享 第六章 抗 体 制 药 Chapter 6 Antibody for Biopharmaceuticals 概 述 1890年Behring和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素，并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。 1937年Tiselius等人用电泳法将血清打败分为白蛋白、甲种（α）球蛋白、乙种（ β ）球蛋白、丙种（ γ ）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。 1975年K?hler and Milstein等首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体 (monoclonal antibody ,McAb)。 McAb 在免疫导向疗法中存在的问题（障碍）： A、McAb均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（HAMA），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有5~6h，维持有效药物作用靶组织时间； B、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。 需要解决的问题： A、降低McAb的免疫源性； B、降低McAb的相对分子质量。 解决问题的方法或途径—基因工程技术 1984年报道了人—鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗体分子的1/80~1/3。 第一节 单克隆抗体（Monoclonal Antibody） 一、制备单克隆抗体的一般流程（图5-1） McAb是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定族的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。 1、抗原与动物免疫 免疫方法：体内免疫和体外免疫 抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原 免疫动物：BALB/c小鼠和Lou大鼠 2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养 用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。 PEG的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓度为40%~50%，相对分子质量4000为佳。相对分子质量在400~6000，浓度在10%~60%范围内的PEG都能使细胞发生融合。为了提高融合率，在PEG 溶液中加入DMSO，以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。 （1）细胞融合液中的细胞类型：4或5种。 （2）如何去除脾-瘤以外的融和细胞？ 3、筛选阳性克隆与克隆化 常用的检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术 常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。 有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用HT培养液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI 1640培养液。 软琼脂法：在培养液中加入0.5%的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态，可用吸管吸出，移入96孔板培养。 4、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定—染色体分析 正常鼠的脾细胞染色体数：40，全部为端着丝粒。 小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为62~68，NS-1为54~64，大多数为非整倍性，有中部和亚中部着丝点。 杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色体数目的总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应出现少数标志染色体。 染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体；反之，则反。 5、单克隆抗体的大量制备 （1）体外培养法：可获得10μm/ml的抗体。多采用RPMI 1640培养液，添加10%~20%胎牛或小牛血清。但由于培养液中含有血清成分，总蛋白量可达100 μm/ml以上，给纯化带来困难。加入小牛血清又是发生支原体污染的原因，而且批间质量差异太大，直接影响杂交瘤细胞的生长。 改良的方法有：无血清培养法、悬浮培养法、微载体悬浮培养法。 无血清培养法：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、