2DE实验流程修正版.pdfVIP

总 蛋 白 制 备 ： 1、 细 胞 收 集 ： 胰 酶 消 化 细 胞 并 用 含 有 FBS的 DMEM终 止 ， 1000g离 心 2min 。 2、 1 × PBS洗 涤 并 1000g离 心 2min （ 在 实 验 前 应 该 进 行 预 实 验 确 定 离 心 力 以 及 离 心 时 间 以 保 6 证 细 胞 离 心 下 来 ）， 共 3次 。 最 后 一 次 离 心 前 进 行 细 胞 计 数 ， 然 后 每 管 为 1.5 × 10 细 胞 分 装 于 1.5ml EP管 中 ， 离 心 后 吸 净 上 清 。 3、 将 蛋 白 酶 抑 制 剂 （ 100 × ） 升 温 至 室 温 。 使 用 前 短 暂 振 荡 搅 拌 ， 使 溶 液 处 于 悬 浮 液 状 态 。 按 1:100比 例 稀 释 于 裂 解 液 中 。 5、 每 管 加 入 100～ 200ul裂 解 液 (含 有 蛋 白 酶 抑 制 剂 )， 振 荡 2min 。 6、 超 声 破 碎 仪 处 理 ： 振 幅 21%， 处 理 2s， 放 置 3s， 共 3min。 处 理 过 程 中 应 该 在 冰 浴 中 进 行 。 7、 冰 上 静 置 1h。 8、 40000g离 心 1h （4 ℃ ）。 9、 取 上 清 进 行 蛋 白 定 量 。EP管 保 存 于 -80℃ 备 用 。 蛋 白 定 量 ： 1、 准 备 工 作 比 色 剂 ： 100份 比 色 剂 A与 1份 比 色 剂 B混 合 （ 每 管 需 要 1ml的 比 色 剂 ）。 2、 使 用 2 mg/ml (BSA)依 据 Table 1准 备 。 3、 制 备 含 1～ 50ul的 待 测 样 本 的 微 量 离 心 管 ， 一 式 两 份 （ 有 效 检 测 范 围 0.5~50ug ）。 推 荐 使 用 2种 不 同 浓 度 的 样 本 以 保 证 在 有 效 检 测 范 围 内 。 4、 每 个 tube加 入 500 μl 沉 淀 剂 ， 振 荡 并 在 室 温 下 培 育 2–3 min。 5、 每 管 加 入 500 μl 共 沉 淀 剂 ， 短 暂 轻 微 混 匀 （ vortexing or inversion ）。 6、 10 000 × g （ 推 荐 最 高 转 速 ） 离 心5 min 以 沉 淀 蛋 白 。 7、 此 时 应 可 见 蛋 白 。 尽 快 弃 去 上 清 （ 倾 倒 ）。 8、 再 次 短 暂 离 心 将 残 余 上 清 离 到 管 底 。 并 尽 量 吸 去 上 清 。 9、 每 个 管 中 加 入 100 μl 铜 溶 液 和 400 μl 超 纯 水 。 小 心 振 荡 使 沉 淀 的 蛋 白 完 全 溶 解 。 10、 加 入 1 ml工 作 比 色 剂 ， 应 确 保 以 最 快 的 速 度 加 入 ， 使 之 与 样 本 立 即 混 匀 。 11、 在 室 温 下 培 育 15–20 min 。 12、 采 用 分 光 光 度 计 在 480 nm测 定 样 本 和 标 准 液 的 吸 光 率 。在 加 入 工 作 比 色 剂 后 40min 内 测 定 。 13、 绘 制 标 准 曲 线 并 得 到 样 本 蛋 白 浓 度 。 （ 一 ） 第 一 向 等 电 聚 焦 （Immobiline DryStrip pH 3-11 NL, 24 cm ） 1. 从 冰 箱 中 取 -20℃ 冷 冻 保 存 的 水 化 上 样 缓 冲 液 （ 不 含 DTT） 一 小 管 （ 1ml/管 ）， 置 室 温 溶 解 。 2. 在 小 管 中 加 入 2.8mg DTT， 充 分 混 匀 。 3. 从 小 管 中 取 出 450-X l 水 化 上 样 缓 冲 液 ， 加 入 X l 样 品 （含 有 150ug 蛋 白 ）， 充 分 混 匀 。 4. 从 冰 箱 取 -20℃ 冷 冻 保 存 的 IPG 预 制 胶 条 （ 24cm pH 3-11 NL ）， 于 室 温 放 置 10 分 钟 。 5. 将 泡 涨 盘 的 保 护 盖 完 全 移 去 ， 调 节 水 平 支 脚 ， 直 至 水