瑞安市副溶血性弧菌临床分离株的血清分型和毒力基因研究.docVIP

瑞安市副溶血性弧菌临床分离株的血清分型和毒力基因研究 　　摘要：目的： 了解瑞安市副溶血性弧菌临床分离株的血清型和毒力基因携带情况。方法： 按照国标GB 4789.7-2013进行血清分型，用PCR方法检测其tdh和trh毒力基因。结果： 52株副溶血性弧菌的O血清型，以O3（42.30%）、O4（30.77%）、O1（11.54%）为主，28株K型不能分型；41株菌株tdh+trh-，4株tdh-trh+，1株tdh+trh+，6株tdh-trh-；所有trh+菌株尿素酶试验阳性。结论 ：瑞安地区副溶血性弧菌临床分离株中O3：K6为最主要的流行血清型，O4：KUT次之；大部分菌株携带tdh毒力基因 关键词： 副溶血性弧菌；毒力基因；尿素酶；血清分型 副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus， Vp）是一种广泛分布于近海岸的海水、海底泥沙、浮游生物和海产品中的一种嗜盐性弧菌。它是引起我国沿海地区食物中毒的重要致病菌。耐热直接溶血素（TDH）和TDH相关溶血素（TRH）是目前公认的副溶血性弧菌主要的毒力因子，与其致病能力密切相关[1]。本文对分离至腹泻病人的副溶血性弧菌临床分离株进行血清学分型，并将TDH毒力基因（tdh）和TRH毒力基因（trh）进行PCR检测，分析毒力基因在临床分离株中的携带分布情况 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株 2013年至2014年本实验室从临床腹泻病人肛拭子分离到的副溶血性弧菌，共52株 1.1.2 主要试剂 尿素酶培养基购自北京陆桥技术股份有限公司。副溶血性弧菌O诊断血清及K诊断血清购自日本生研株式会社。PCR引物合成和相关试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。引物序列见表1 1.2 方法 1.2.1 尿素酶试验 将待测菌株接种于尿素培养基，37℃培养24小时。培养基颜色变为玫红色，则为阳性反应，不变色则为阴性 1.2.2 副溶血性弧菌血清分型 参照GB 4789.7-2013进行[2] 1.2.3 副溶血性弧菌毒力基因分析 1.2.3.1模板DNA制备：用接种环挑取1-2环纯培养物于150μl无菌纯水中混匀，100℃煮沸10分钟，12000r/min离心10min，取上清液保存于-20℃备用 1.2.3.2 PCR反应体系：2×PCR预混体系25μl，20μmol/L上下游引物各1μl，双蒸水21μl，模板2μl，终体系为50μl。扩增条件为94℃预变性5min，然后按94℃变性1min，55℃退火1min（tl基因为58℃），72℃延伸1min，循环30次，最终72℃延伸5min。用双蒸水做阴性对照，用阳性菌种ATCC33847（tdh+ trh- tl+）和ATCC17802（tdh- trh+ tl+）的DNA做阳性对照 1.2.3.3 PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析：分别取5μlPCR产物和DNAmarker于1%琼脂糖凝胶上进行电泳 表1 PCR引物序列、退火温度及产物大小 注：tl基因为副溶血性弧菌的种属特异性基因 2 结果 2.1 副溶血弧菌血清型分布情况 52株副溶血性弧菌中，检出O3血清群22株（42.30%），占比最大，其中O3：K6有19株，O3：KUT（K型不能分型）占3株；O4群16株（30.77%），其中O4：KUT有14株，O4：K4，O4：K8各一株；O1群6株（11.54%），K型均为不能分型；O10群4株（7.69%），O10：K60有3株，1株K型不能分型；O5群3株（5.77%），K型均为不能分型；O8群1株，K型不能分型，详见表2。未检测到O2，O6，O7，O9，O11血清型。超过半数的菌株K型不能分型（28/52） 表2 副溶血性弧菌血清型分布和毒力基因携带情况 2.2 毒力基因检测及尿素酶试验结果 经PCR检测，所有菌种均携带tl基因，确定为副溶血性弧菌。携带tdh基因而不携带trh基因的菌株（tdh+trh-）占41株（73.85%），tdh-trh+占4株（7.69%），tdh-trh-占6株（11.54%），tdh+trh+占1株（1.92%），其血清型为O10：KUT，见表2。部分样本tdh、trh基因扩增电泳图见图1。5株trh基因阳性的菌株其尿素酶试验呈阳性，其余菌株尿素酶试验阴性 图1 部分副溶血性弧菌tdh、trh基因PCR扩增电泳图 3 讨论 本研究对52株分离自腹泻病人的副溶血性弧菌的血清型分析表明，O3：K6是本地副溶血性弧菌临床分离株的主要血清型，O4：KUT其次，O1：KUT列第三。近年来，除了O3：K6外，O4：K48，O4：K68，O1：K25和O1：KUT引起多次