淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术——王进.pptVIP

主要内容 一、细胞融合前准备　　　　 二、细胞融合，选择杂交瘤　　　　 三、抗体的检测　　　　 四、杂交瘤的克隆化和冻存　　　　 五、单克隆抗体的大量生产　　　 六、单克隆抗体的鉴定　　　　 七、影响因素，失败原因分析　 一.细胞融合前准备 (一)　免疫方案 (二)　饲养细胞 (三)　骨髓瘤细胞　 (四)　免疫脾细胞 　 颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。 下面是以细胞性抗原为例的免疫方案:　　　　　　　　　　 初次免疫　　1×10７/0.5ml ip (腹腔内注射)　　　　　　　 ↓　2～3周后　　　　　　　　　　 第二次免疫　1×10７/0.5ml ip 　　　　　　　　↓　3周后　　　　　　　　　　 加强免疫(融合前三天)　1×10７/0.5ml ip或iv(静脉内注射)　　　　　　　　　 ↓　　　　　　　　　 取脾融合 　 2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂， 常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。 要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。 商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。　　　　 初次免疫　 Ag　1～50μg　加福氏完全佐剂皮下多点注射　　　　　　　│(一般0.8～1ml　0.2ml/点)　　　　　　　↓3周后 第二次免疫　剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip　　　　　　　│(ip剂量不宜超过0.5ml)　　　　　　　↓3周后 第三次免疫　剂量同上，不加佐剂，ip　　　　　　　│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)　　　　　　　↓2～3周后 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv　　　　　　　↓3天后　　　　　　 取脾融合　　 (二)　饲养细胞 小鼠腹腔巨噬细胞的制备　　　　 小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用Balb/c小鼠6～10周龄　　　　　　↓　　　 拉颈处死　浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟　　　　　　↓　　　 用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜　　　　　　↓　　　 用无菌注射器注入6～8ml培养液　　　　　　↓　　 反复冲洗，吸出冲洗液　　　　　　↓　　 放入10ml离心管，1200转/分，离心5～6分钟　　　　　　↓　　　　 用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数1×105/ml　　　　　　↓　　　　 加入96孔板，100μl/孔　　　　　　↓　　　 放入37℃　CO2孵箱培养　 小鼠腹腔巨噬细胞的制备　　　　 (三)　骨髓瘤细胞 常用骨髓瘤细胞系：NS1、SP2/0、X63-Ag8.653等。　　 培养液：RPMI1640，DMEM培养基。 (四)　免疫脾细胞 　 免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞浆母细胞。　　 脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。 一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。　 二.细胞融合,选择杂交瘤　 (一)　细胞融合流程 (二)　HAT选择杂交瘤 (一)　细胞融合流程 　 (1)　取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。　　(2)　同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。　　(3)　将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10或1:5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。　　(4)　弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。　　(5)　轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。　　(6)　在室温下融合: ①30秒内加入预热的1ml45％PEG,含5％DMSO，边加边搅拌。 ②作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。 ③加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。　　(7)　离心，800rpm，6分钟。　　(8)　弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。　　(9)　根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。　　(10) 将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl/孔，37℃、5％CO2孵箱培养。一般