17β羟基类固醇脱氢酶10在小鼠内耳的表达与意义.docVIP

17β - 羟基类固醇脱氢酶10在小鼠内耳的表达与意义 作者：林昶　严世都　汪晓锋　张榕 作者单位：福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科， 福建省耳鼻咽喉研究所（福州　350005） 【关键词】 小鼠 　　17Β-羟基类固醇脱氢酶10（17Β-HSD10），又称短链-3-羟酰辅酶A脱氢酶（SCHAD），是位于细胞线粒体的多功能酶，参与能量代谢及激素的代谢等，在大脑的发育和老化过程起重要作用，异常时可影响神经元的能量代谢及自由基的产生，促进神经元的凋亡，导致一些神经系统疾 病［1］。本文研究小鼠内耳中该蛋白的存在与否及表达情况，分析其在内耳退行性病变的可能作用。 1　材料与方法 1.1　动物　4月龄C57BL/6及B10PL小鼠6只、B6D2F1/J小鼠8只，均来自美国哥伦比亚大学医学中心。 1.2　蛋白印迹检测内耳中17Β-HSD10 　　快速断头处死小鼠，取颞骨放置于-4℃，解剖镜下取出耳蜗、去除骨壁，3只鼠6个耳蜗置于0.15 ml Tris缓冲液中［10 mmol/L Tris, 0.1 mol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸）, 100 Μg/ml PMSF（phenylmethanesulfonyl fluoride）, 1 mg/ml Aprotinin（抑肽酶）］机械匀浆。 1 700 rpm 4℃离心5分钟，取上清液测蛋白浓度，按Joyce［2］ 等的方法用12% 十二烷基磺酸钠聚丙烯凝胶电泳、转膜，Anti-ABAD（Abeta-binding alcohol dehydrogenase, 1：1 000，美国哥伦比亚大学医学中心外科系赠送）作用1小时，二抗（1： 500）作用1小时，荧光显色剂2分钟，胶片曝光2分钟。 1.3　免疫组织化学对17Β - HSD10定位 　　取2只B6D2F1/J小鼠，用氯胺酮-甲苯噻嗪合剂 （0.2 ml／kg）腹膜内注射麻醉后，用0.1 mol/L磷酸缓冲液（PBS，pH 7.4)及4％ 多聚甲醛进行心内灌流固定。在解剖显微镜下取出耳蜗后，浸入相同的固定液中，4℃ 固定 24 h，10% EDTA脱钙。PBS清洗，梯度酒精脱水、石蜡包埋、定向切片，片厚5 Μm，一抗Anti-ABAD（1：200）室温1小时，然后按SP试剂盒（迈新公司）说明进行染色。 2　结　果 2.1　蛋白印迹 　　C57BL/6、B10PL、B6D2F1/J小鼠内耳均可检出17Β-HSD10，蛋白表达量基本相似（图1）。 2.2　免疫组化 　17Β-HSD10阳性染色主要位于耳蜗的螺旋神经节细胞（SGC）的胞浆（图2）。 3　讨　论 　17Β - HSD10是一个多功能的线粒体代谢酶，存在于线粒体的基质。属短链脱氢酶/还原酶，它通过影响线粒体的呼吸链酶，参与三羧酸循环。在大脑发育与老化过程中起重要的作用，但在脑组织的不同区域的细胞表达不同。在急性动物脑缺血实验中，该蛋白的过度表达能通过三羧酸循环增加乙酰辅酶A及脑中的ATP水平，可减少脑缺血的面积及神经损伤［3］。在帕金森病慢性脑损害，也可通过调节氧化磷酸化及ATP的产生而对神经元产生保护作用［4］。而在阿尔茨海默病研究中［2］，发现该蛋白与淀粉样蛋白高效特异结合，促进氧自由基的产生和线粒体功能的失调，引起神经元的凋亡。在体内外实验中发现该蛋白反序列多肽对脑神经元有一定的保护作用。 　另外该蛋白还是调节细胞内雌激素水平的一个重要类固醇代谢酶，可抑制睾丸激素合成雌激素，并可使雌二醇失活［1］。雌激素对神经元有保护作用，其机制包括：激活细胞核激素受体并激发神经保护因子，上调抗凋亡蛋白bcl-2的表达而达到抗凋亡的作用。17Β-HSD10的高表达使细胞内的雌二醇处于缺乏状态，削弱雌激素的神经元保护 作用。 　以往的研究在肝、心、脑、肾、性腺等器官可检出17Β-HSD10，但在各器官及同一器官的不同区域表达水平不同。我们的研究首次发现在不同种系小鼠的内耳也表达该蛋白，并主要存在于螺旋神经节神经元中。根据以往该蛋白与脑神经元细胞病变的相关研究，我们有理由推测该蛋白对于螺旋神经节细胞的生理和病理的过程有调节作用。 　　目前有许多研究证实氧化应激反应与老年性病变如中枢神经系统的变性反应相关，而且与老年聋密切相关。细胞在新陈代谢的过程中产生许多过氧化物，并随着年龄的增加而增加，对生物膜造成严重损害，破坏细胞膜内外离子的正常浓度差；也可