朗德鹅肝脏脂平衡调节的初步研究《南京农业大学》2009年博士论文.doc

朗德鹅肝脏脂平衡调节的初步研究--《南京农业大学》2009年博士论文 从分子水平上筛选影响鹅肥肝性状的主效基因,并在早期选择有较大产肝潜力的朗德鹅是迅速提高鹅产肝性能和朗德鹅产业经济效益的方法之一。然而朗德鹅肥肝性状受众多基因和信号途径的调控,难以确定控制鹅肥肝性状的主效基因,因此从信号通路和基因表达调控网络的角度进行分析将是揭示鹅肥肝形成的分子机制的有效途径。 针对朗德鹅肥肝性状的特点,文章通过图论的方法从整体上把握肝脏脂平衡的调控网络,然后寻找网络中具有整体调节作用的信号通路,并从试验的角度分析填饲造成网络中重要节点和脂代谢相关基因的表达变化。而对于图论发现的调控通路也必须通过试验的方法验证和分析。 根据原始的研究文献、综述及分子生物学数据库,将分子实体作为顶点,分子实体名称对应标记分子网络中的分子实体,边对应于分子实体间的关系,对分子调控网络资料进行收集,并构建对应的邻接矩阵。然后将原始各个邻接矩阵综合为分子调控网络综合邻接矩阵。 根据邻接矩阵A,通过计算R=A+A2+A3+…+An,得到可达矩阵。然后根据可达矩阵所研究分子所在的行和列的数据资料来判断分子间的调节与被调节关系。将分子调控网络的邻接矩阵Spath进行k次幂来判断肝脏脂代谢核心相关分子调控网络中的分子的上游与下游信号分子间的调控关系、路径长度及路径数。依据综合邻接矩阵,通过Matlab软件绘制了以核心基因为基础的肝脏脂代谢调控图。 填饲后朗德鹅的肝重、腹脂重、肝重指数和体重显著增加。通过CT分析发现对照组肝脾比值大于1,而填饲组肝脾比值呈负数,与人的脂肪肝结果分析类似。在血清生化指标方面,填饲组朗德鹅血清谷丙转氨酶、甘油三酯和H-胆固醇与对照组相比差异极显著；胆碱脂酶显著高于对照组。通过组织切片分析发现：填饲处理后,朗德鹅肝脏细胞胀大,并且细胞质内充满大小不等的脂泡。通过气相色谱法测定了朗德鹅肝脏的脂肪酸组分发现：填饲可以降低朗德鹅肝脏中饱和脂肪酸、C18:2、C20:4、PUFA、SFA/UFA的含量、PUFA/UFA和PUFA/MUFA的值；提高MUFA、C18:1、UFA的含量和MUFA/UFA的值(P0.01)。 用荧光实时定量PCR法检测了填饲对脂生成相关基因和相关分子mRNA表达的影响。结果显示：与对照组相比,填饲可以显著提高朗德鹅肝脏中ACCα、PPARα、aP2、LXRα、PPARγ、Spot14α、Spot14β、C/EBPα、C/EBPβ、GH基因mRNA的表达水平。肝脏组织中ACCα、LXRα基因的表达量与血清TG含量呈极显著正相关。而肝脏组织中aP2、LXRα、PPARγ基因的表达量与肝重指数呈极显著相关(P0.01)。填饲可以降低SREBP1c基因mRNA的表达量(P0.05)。肝脏组织中SREBP1c基因的表达量与肝重指数呈极显著相关(P0.01),与血清TG成负相关(P0.05)。 T3处理可以显著提高体重、肝重(P0.01),添加甜菜碱后可以逆转这种变化。与对照组和填饲组相比,T3处理可以显著提高血清Che, HDL和LDL的浓度,但是添加甜菜碱不能够逆转这种变化。T3处理组空泡数量明显减少,细胞质内脂滴增加,肝细胞膨胀。添加甜菜碱后,空泡数量进一步减少,肝细胞内脂滴比较均匀,细胞结构的变化得到有效的逆转。相对于填饲组,T3处理组显著提高肝脏中不饱和脂肪酸的含量(P0.05),并且添加甜菜碱后可以逆转这种变化。 相对于填饲组,T3处理可以显著提高ACCα基因的表达量,添加甜菜碱后可逆转T3处理对ACCα基因表达量的影响。相对于填饲组,T3处理可以显著降低PPARγ、PPARα、C/EBPβ、LXRα和GH基因mRNA的表达量(P0.01),显著提高aP2基因mRNA的表达水平,添加甜菜碱后可逆转T3处理对GH和aP2基因表达量的影响(P0.05)。肝脏组织中ACCα, Spot14α基因的表达量与血清TG呈极显著相关。肝脏中SREBP1c基因mRNA表达量与肝重指数呈极显著负相关,与血清TG呈显著负相关(P0.05)。 相对于填饲组,添加甜菜碱后肝重和肝重指数显著增加,腹脂重降低,血清中Che,HDL, ALT浓度显著增加(P0.01),而TG和LDL浓度没有受到甜菜碱的影响。甜菜碱处理后,空泡数量明显减少,脂滴沉积分布均匀,数量较多。然而添加甜菜碱对脂肪酸组分没有影响。相对于填饲组,甜菜碱处理可降低C/EBPβ、PPARα、Spot14β、PPARγ和LXRαmRNA的表达水平(P0.01)。而甜菜碱处理后可以显著提高Spot14α基因mRNA的表达。 Spot14αcDNA全序列长792bp,与鸭比有87%的同源性,并已提交到基因库中,序列号为EU710582,编码128个氨基酸,与鸭比有84%的同源性