目的基因片段与克隆载体质粒的连接操作步骤.doc

连接反应总体积为10μL，体系组成如下： 回收纯化的PCR扩增目的基因片段??????????? 7.0μL 10×Ligation buffer??????????????????????1.0μL T载体（10ng/μL）????????????????????????1.0μL T4 DNA ligase????????????????????????????1.0μL 共10.0ul 混均后，4℃连接18-24小时，连接所得克隆载体命名为TA-VP4-STI。 ? 转化操作方法 1）取一管-80℃保存的感受态细胞，置冰上融化； ? 一次转化感受态细胞的建议用量为50-100ul,应注意所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。以100ul为例： ? 2）加入连接物（50ul的感受态细胞能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和），轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min； ? 3）将离心管置于42℃热击60-90秒，然后迅速置冰浴2-3分钟，该过程不要摇动离心管； ? 4）向每个离心管中加入500ul液体LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床振荡培养45分钟（150转/分钟）；目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。 ? 5）将离心管内容物混匀，吸取100ul已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的LB固体琼脂培养基上（含50 ug/ml氨苄青霉素），用无菌的弯头玻棒轻轻将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16小时。至红、白斑区分明显为止。 ? 涂布用量可根据具体试验来调整：如转化的DNA总量较多，可取更少量转化产物涂布平板；反之，如转化的DNA总量较少，可取200-300ul转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少，可通过离心（4000rpm,2min）后析除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板） ? 注意事项： 1、感受态细胞应保存在-70℃，不可多次冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。 2、进行转化操作时，应根据相应温度及无菌条件的要求进行。 3、为防止转化试验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，将损失降到最低。 4、氨苄青霉素(Amp)：使用前用无菌纯水配制母液，浓度为50mg/mL。